葡糖胺合酶(GlmS)酶抑制活性筛选方法研究.pdfVIP

葡糖胺合酶(GlmS)酶抑制活性筛选方法研究 王 维 张建军金淑 慧 梁晓梅 王道全 中国农业大学应用化学系，北京 100193 摘要：葡糖胺合酶(GlmS)普遍存在于多种生物体和组织中，该酶是催化UDP-N-乙酰葡糖胺合成的关键酶， 能够影响生物体内多种生物大分子的合成.实验室克隆、表达、提取并纯化GlmS，并建立了酶抑制剂的 筛选方法以进行杀菌活性化合物GlmS酶抑制活性研究，初步结果表明，实验室以GlmS酶为靶标设计合 成的多个化合物均有较好的酶抑制活性与杀菌活性，二者具有一定的相关性. 关键词：葡糖胺合酶；酶抑制剂；活性筛选 “第十届全国新农药创制学术交流会”论文集 l主要仪器和材料 (His,Leu,Met,Ura)等。 棉花枯萎病，病原[Fusariumoxysporumfsp]：番茄灰霉病，病原[BotrytiscinereaPers．】；茄棉疫病， 病原LPCapasiciLeonian]：油菜茵核病，病原【Sclerotiniasclerotiorum仁f6Jde驯；稻瘟病，病原 solani [PyriculariaoryaeC洮】：棉花立枯病，病原[RhizoctoniaKuhn．】等植物病原菌。 Coulter L．90K制备型冷 基因克隆相关试剂和仪器；Eppendorf5415D台式离心机；BeckmanOptima 冻离心机；UV-4802双光束扫描性紫外分光光度计等。 取及活性测定相关试剂掣61。 实验室已合成的待检测化合物A系列和B系列，及对照药剂百菌清等。 2实验方法与结果 2．1克隆白假丝酵母菌(ATCCl0231)的GFAl基因 酶(BamHI和Xhol SK质粒，经验证正确后扩增，然后将GFAl基因 I)将目的基因连入pBluescript 连入表达载体。构建成功的表达载体用热击法导入酿酒酵母细胞，用缺陷培养基SC．U筛选正确的重组 子并酶切验证(图2)，最后用2％半乳糖诱导葡糖胺6磷酸合成酶基因表达。 2．2葡糖胺—纠霹酸合成酶的提取 葡糖胺．6磷酸合成酶部分纯酶提取的主要实验流程为：冷冻离心收集茵体，氧化铝研磨法破碎酵母 细胞，25mM磷酸钾缓冲液提取，1％鱼精蛋白硫酸盐溶液沉淀，最后用0．1M焦磷酸钾缓冲液溶解，获 钟生成1p．mol葡糖胺．昏磷酸所需要的酶量【6，7，8】。 表达，且提取出的酶液可用于化合物活性检测。 攀辫蘩囊鲮褫 田1白假丝酵母菌GFAlPCR产物电泳图 圈2表达载体酶切鉴定图 -．299． GlmSinhibitoryactivityscreeningmethodinvestigation WangWei JinShuhui ZhangJianjun LiangXiaomeiWangDaoquan DepartmentofAppliedChemistry,ChineseAgriculturalUniversity,Beijing100193,China Abstract:AsacheckpointofUDP-GlcNAcsynthesis,glucosamine-6-phosphatesynthase(GlmS)isvery importanttotheformationofnumerousbiomacromoleculesandbecomethefocusofpotentialtargetsforthe developmentofnovelfungicidalagents.InordertosetuptheGlmS-inhibitionsystemoftheinhibitors,GlmS enzymewascloned、 expressed、 andtheenzymewasextractedandpurified.Preliminaryenzyme-inhibi