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第十九章 在基因水平诊断疾病 基因诊断（gene diagnosis ）的概念： 利用分子生物学技术，从DNA 或RNA 水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态， 从而对疾病作出诊断。 第一节 目标序列的识别和定性定量分析是基因诊断的基础 基因诊断经历了三个基本发展阶段： 第一阶段：２０世纪８０年代，以DNA 分子杂交为基础，通过限制性片段长度多态性性（RFLP) 分析进行． 第二阶段：应用PCR 技术． 第三阶段：应用基因芯片技术 一.基因诊断的基础技术 （一）核酸杂交( Molecular Hybridization ) （1）利用具有一定互补序列的两种核酸单链（探针和目标）在液相或固相体系中可缔合成异质双链的 原理，用以分析被测样品中特定目标序列的方法。 (2)几种不同形式的核酸分子杂交 a. Southern 印迹(southern blot)杂交: 用于DNA 的检测，可用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突 变分析等． b. Northern 印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA 的检测，能对组织细胞中的总RNA 或mRNA 进行定 性和定量分析． c. 斑点杂交（dot blot): 既可以检测 DNA 也可以检测 RNA,用于特定基因及其表达的定性和定量分 析．方法简单、灵敏；但特异性低． d.原位杂交（in situ hybridization): 是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核酸分析检测技术．可 分为DNA 原位杂交和RNA 原位杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于染色体疾病的诊断． (二)PCR 技术在基因诊断中的应用 （１）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交： PCR-ASO （２）单链构象多态性（single strand conformation ploymorphism,SSCP)分析 是一种基于单链DNA 构象差别来检测点突变的方法．DNA 变性形成单链，在中性条件下长度相 同的单 链指 DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的构象就不同,这样就形成了单链构象多态 性.这些分子在非变性PAGE 中电泳中表现出不同的迁移率. (3)限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphisms,RFLP ）分析 基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序发生改变,会在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或 使原有的位点消失. 用限制酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳条带的数目和大小就会产生改变， 根据这些改变可以判断出突变是否存在. (4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术 双链DNA 在一定浓度变性剂(尿素, 甲酰胺)作用下,会变性而解链,导致DNA 分子电泳迁移率变化. 当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA 泳动到变性剂浓度能使DNA 发生变性，DNA 开始解链，从 而不同的DNA 片段会形成不同的迁移率条带． （５）用甲基化特异性PCR （methylation-specific PCR)进行分析 (6)采用PCR 技术对靶核酸进行定量分析 a. 通过测定PCR 产物量 b. 采用极限稀释法对靶核酸进行定量分析: service@100 c.采用非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析 d. 采用竞争抑制法对靶核酸进行定量分析: e.荧光定量PCR(FQ-PCR)技术 （三）DNA 序列测定 用放射性同位素标记引物，用双脱氧核苷酸随机终止DNA 链的延伸，产生长度不同的DNA 片段，再 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。 （四）DNA 芯片技术 DNA 芯片（DNA chip)又称为基因芯片，DNA 微阵列（DNA microarray) 该技术的基础仍然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好的核酸探针（oligos or cDNA) 有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成 DNA 微阵列。用荧光标记待测 样品（DNA,cDNA,RNA)与位于芯片上的核酸探针杂交后，通过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信 号强度，再用特定的软件对荧光信号进行综合分析，就能获得待测样