定量测定重组人睫状神经营养因子活性的新方法.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（２）：８６～８９ 定量测定重组人睫状神经营养因子活性的新方法  周　虎 　汪　怡　朱俊铭 （湖北丝宝药业有限公司生命科学研究所　武汉　４３００５６） 摘要　目的：建立一种能定量测定重组人睫状神经营养因子（ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ，ＣＮＴＦ）生 物学活性的新方法。方法：从鸡胚中分离出背根神经节并制成神经细胞，将重组人睫状神经营养 因子加入到细胞中继续培养６４ｈ后，用酸性磷酸酶法检测活细胞内酸性磷酸酶的活性，从而定量 测定重组人睫状神经营养因子的生物活性。结果：重组人睫状神经营养因子有促原代鸡胚背根 神经细胞存活作用，细胞存活率与加入重组人睫状神经营养因子的量成正相关。结论：通过检测 存活的原代鸡胚背根神经细胞内酸性磷酸酶的含量来定量测定重组人睫状神经营养因子生物活 性的实验方法具有干扰因素少、定量准确、重复性好等优点。 关键词　睫状神经营养因子　酸性磷酸酶　神经细胞　生物学活性 中图分类号　Ｑ８１９ 　　睫状神经营养因子（ＣＮＴＦ）是神经生长因子家族 支，加入 １ｍｌ基础培养基复溶后，用基础培养基稀释成 之外的另一类型神经营养因子，最初从鸟的睫状神经 每１ｍｌ含２０Ｕ，然后依次做３倍系列稀释，共９个稀释 节中提取出来，它对外周及中枢神经元有广泛的促存 度，每个稀释度做３孔。以上操作在无菌条件下进行。 活作用，对星形胶质细胞有促分化作用，对少突胶质细 　　供试品溶液的制备：用基础培养液稀释成每 １ｍｌ ［１］ 约含２０Ｕ，然后依次做３倍系列稀释，共９个稀释度，每 胞有促存活及成熟作用 。ＣＮＴＦ自２０世纪７０年代 发现以来倍受重视，在临床研究中很有意义。 个稀释度做３孔。以上操作均在无菌条件下进行。 ［４］ 　　介绍了一种定量测定 ＣＮＴＦ活性的新方法—鸡胚 　　在无菌条件下摘取适量鸡胚背根神经节 ，经消 ［５，６］ 背根神经细胞／酸性磷酸酶法，该方法相对于传统的鸡 化液消化，吹打分散成单细胞悬液 ，并用含３％胎牛 ［２，３］ ４ 胚背根神经节培养法 的半定量法，可以避免人为主 血清的完全培养基将细胞浓度配制到６．０×１０个／ｍｌ， 观误差，使测定结果更准确。 加入到经鼠尾胶原包被的９６孔细胞培养板中，每孔 １００ｌ细胞悬液，于３７℃，５％ＣＯ 培养４～５ｈ。吸尽各 μ ２ １　材料与方法 孔中培养液，每孔依次加入用基础培养基系列稀释的 １．１　材　料 供试品溶液１００ｌ（相同浓度做２～３个复孔），同时用 μ １．１．１　标准品，重组蛋白与动物　ｒｈＣＮＴＦ国际标准品 基础培养基做阴性对照，于３７℃，５％ＣＯ 培养６０～ ２ 购自ＮＩＢＳＣ；ｒｈＣＮＴＦ蛋白为本所制备；