敲低ABCG1慢病毒表达载体的构建及功能检测.pdfVIP

巾国心血管杂志2014年 8月第 l9卷第 4期 ChinJCardiovascMed，Auzust2014．Vo1．19．No．4 · 277 · ． 基 础 研 究 ． 敲低ABCG1慢病毒表达载体的构建及 功能检测 刘芳 王伟 陈连凤 方全 严晓伟 【摘要】 目的 为探讨人急性单核细胞 白血病细胞系(THP一1)中胆固醇转运相关的ABCG1基 因的表达对动脉粥样硬化发生发展的作用 ，构建ABCGI慢病毒干扰载体，并验证干扰效果 、进行功能 检测。方法 针对人ABCG1的cDNA序列，设计两个 RNA干扰的寡核苷酸单链 DNA。将其插入到 慢病毒表达载体上；将构建的载体和包装质粒共转染293T细胞：通过实时荧光定量PCR及蛋 白质免 疫印迹检测干扰载体对 ABCG1表达水平 的影响；通过检测外流率进行功能验证。结果 构建的 ABCG1基因的小干扰 RNA慢病毒表达载体感染 THP一1细胞可以有效地抑制 ABCG1mRNA和蛋 白 表达水平，且 减少 ABCG1介 导的胆 固醇外流，感 染组外流率小 于对 照组 (23。87％-4-0．45％ 比 30．57％±1．00％，P0．001)。结论 慢病毒表达载体成功敲低THP．1细胞的ABCG1，并为后续 的 ABCG1在巨噬细胞中生物学作用的研究创造条件。 【关键词】 ABCG1；慢病毒载体；RNA干扰 ConstructionofalentiviralvectorofABCG1shorthairpinRNA andfunctiondetection LiuFnng， WangWei，ChenLianfeng，FangQuan，YahXiaoweLDepartmentofCardiology，PekingUnionMedical CollegeHospital，PekingUnionMedicalCollege，ChineseAcademyofMedicalScience，Belting100730， China Correspondingauthor：YanXiaowei，Email：xswy _ pumc@ 163．eom Thiswork 珊supportedbyagrantfromtheNationalNaturalSciencesFoundationofChina (No． 【Abstract】 Objective ToinvestigatethebiologicalfunctionofhumanlipidtransportergeneABCG1 inTHP一1celllineinthedevelopmentandprogressionofatherosclerosis，thelentiviralvectorofABCG1short hairpinRNA (shRNA)wasconstructedanditsknockdowneffectandfunctionwasdetermined．Methods ABCG1shRNAwasdesignedandconstructedbasedhumanABCG1cDNAsequenceusingalentiviralvector． TheexpressionofABCG1wasmeasuredbyreal—timePCR andWesternblot，andfunctionwasexaminedby Cholesterolefflux assay． Results Constructoflentiviralvectoreffectively inhibited ABCG1mRNA and protein levels and decreased the ABCG1一mediated cholesterolefflux from THP一1一derived macrophages． (infectiongroup：23．87％ ±0．45％ US．controlgroup：30．57％ ±1．00％，P0．001)．Conclusions A lentivirusRNA inferencevectortargetingABCG1geneissuccessfullyconsturcted，whichprovidedTHP一1 cellmode1forfu