基于微流控芯片酶反应热力学参数研究.pdfVIP

2010年微纳尺度分离和分析技术学术会议暨第六届全国微全分析学术会议 基于微流控芯片的酶反应热力学参数研究 陈璐，吴增强，夏兴华* 南京大学化学化工学院生命分析化学教育部重点实验室，江苏，南京，210093 在常规酶学研究中，酶催化反应的热力学参数的测定一般是采用量热仪来进行，但是对 于一些快速酶催化反应，使用常规的量热仪无法完成参数的测定。由于在一定的温度范围内 （酶的变性温度之外），Arrhennius 公式仍可以描述酶催化反应的动力学参数与反应的活化 能之间的关系。另外，鉴于固定化酶是研究酶在生物体内性态的理想模型，它能更好模拟酶 在生物体内状态及催化过程。因此本文以微流控芯片为平台，研究了不同温度对固定化酶的 快速催化反应的影响。通过测定不同温度下的葡萄糖氧化酶的米氏常数，建立酶催化反应的 米氏常数与反应的热力学函数之间的关系。为研究酶催化作用的原理和酶的热稳定性提供支 持。 芯片中酶的固定方法如图1 所示，首先用波长为254 nm 的UV光通过预先设计图形的掩 膜对PC 片（聚碳酸氨酯片）进行光照，在PC 片上需要固定酶的区域形成羧基，然后在 EDC/NHS溶液中胺化处理后，最后通过共价结合的方式固定葡萄糖氧化酶（GOD ）。将管道 宽度为75 μm 的PDMS与固定了酶的PC片结合构建微流控温控分析平台。由于酶的变性温度 随着反应时间的增加而降低，所以我们通过提高芯片电动力驱动的电场强度来加速反应时 间。电场强度的选择在图2 中标出。实验中以铂微电极为工作电极，Ag/ AgCl 电极为参比电 极，Pt丝电极为对电极，检测酶催化反应的产物H2O2 （检测电位为0.9 V ）。 图1. 葡萄糖氧化酶固定方式及微流控平台的构建。 图2 为恒温298.15K ， 底物的浓度为 10 mM 葡萄糖，获得的检测信号与不同驱动电压 的关系图。所测电流信号在200-600 V 的范围内相对较稳定，而进一步提高驱动电压至800 和1000 V 时，底物在酶催化作用下产生的检测信号有明显增长。考虑到焦耳热效应及出峰 时间等，最终选取800 V 为驱动电压。 在 800V 进样电压下得到不同温度的米氏常数如图 3A 所示，可以看到，在 298.15 K-318.15 K 的温度范围内，随着温度升高，酶反应的米氏常数降低，在310.15 K 时，酶反 应的米氏常数达到最低，也可以说是酶催化活性最好。之后随着温度进一步升高，由于酶活 性在高温下降低，米氏常数再次变大。由图3B 可以看出，低于310.15 K 时，lnKm-1/T 呈 2010年微纳尺度分离和分析技术学术会议暨第六届全国微全分析学术会议 线性，而过高的温度则导致酶失活，从而偏离线性。因此我们在在298.15-308.15 K 的范围 内，在重新制作的芯片上进一步实验，得到如下米氏常数与温度之间的关系（图 4 ），证明 在温度310.15 K 以下时，酶的催化能力是随着温度的升高而升高的。由于芯片之间的重现 性的问题仍需解决，所以图4 中米氏常数的计算值于图3 相比变化较大。下一步的工作是通 过一系列实验来保证实验结果的重现性和通过实验测定的米氏常数来求得葡萄糖氧化酶催 化反应的热力学参数。 0.32 0.30 A 0.28 n / t n e 0.26 r