脐血间充质干细胞玻璃化冻存.pdfVIP

中国工程热物理学会 传热传质学 学术会议论文 编号：093097 脐血间充质干细胞的玻璃化冻存 1 1 1, * 2 2 李 ，王海燕 ，吕树申 ，柯晖 ，李国喜 赟 （1.中山大学化学与化学工程学院，广州 510275 ） （2.深圳北科生物科技有限公司，深圳 518000） (Tel: 020 Email: lvshsh@mail.sysu.edu.cn) 摘要：干细胞的研究和应用是21 世纪生命科学研究的热点，其中低温保存是干细胞应用的关键，其中 低温保护剂的研究是基础。本文详细研究了两种渗透性保护剂的浓度对细胞的毒性，考察了不同保存 方法低温保存过程中的降温速率，结果表明，我们实验使用的联合低温保护剂具有良好的保存效果， 复温后细胞存活率达到80%以上，尤其是加入PVA 后，细胞的存活率达到了95%以上。经过我们对细胞 冻存液进行DSC 曲线验证，证明了我们配制的低温保护剂具有良好的抑制冰晶的作用。 关键词：干细胞 玻璃化 低温保护剂 降温速率 0 前言 干细胞及其衍生组织器官的广泛临床应用，将产生一种全新的医疗技术，也就是再 造人体正常的甚至年轻的组织器官，从而使人能够用上自己的或他人的干细胞或由干细 胞所衍生出的新的组织器官，来替换自身病变的或衰老的组织器官。因此，干细胞的低 温保存成为干细胞应用的关键。近半个世纪以来，很多学者致力于生物材料的低温保存， 并取得了很大的进展。但迄今为止，还没有一种生物细胞经冷冻后仍100%地保持活性， 低温损伤主要是溶质效应和冰晶的机械效应引的起的[1]。 目前，脐带间充质干细胞的低温保存主要采用慢速冻存的方法，该方法程序繁琐， 价格昂贵。玻璃化保存方法操作简单，不用高价的程序降温仪器，价格便宜。但是玻璃 化方法需要高浓度的低温保护剂，对细胞造成很大的伤害，因此，开发一种低毒性，玻 璃化能力强的低温保护剂是我们的首要目标。 本实验经过长期文献论证，使用了两种渗透性好，低毒性的低温保护剂加上蔗糖聚 乙烯醇等非渗透性低温保护剂，经过实验，取得了良好的效果。并通过实验考察了几种 不同的冷冻方法的降温速率，选择了最合适的冷冻方法。 1 材料方法 1.1 仪器试剂 脐血间充质干细胞（深圳北科生物科技有限公司）;离心机（湖南湘仪）；液氮灌（亚 西）；微量移液枪（DragonMed ）；荧光显微镜（重庆奥特）；麦管（进口）；渗透性保护 国家重大基础研究前期研究专项资金资助（资助编号：2005CCA01400 ） 剂A、B；蔗糖（分析纯）；聚乙烯醇PVA （药用级）；台盼蓝（Sigma）；超纯水（中山大 学）等。 1.2 实验方法 （1）为了测定保护剂的浓度对细胞造成的毒性以及细胞在可承受浓度范围内的保 存时间，配制了不同浓度的低温保护剂，分别和细胞悬液混合成一定的浓度，然后采用 台盼蓝染色，置于显微镜下，用图像采集系统拍摄不同时间的干细胞图片，计算细胞的 存活率。存活率=活细胞/总的细胞。 （2）用普通0.25ml 麦管加热拉长到原来长度的两倍左右，从中间截开制成拉长麦 管。用热电偶及安捷伦温度采集系统测试了普通麦管及拉长麦管的降温升温速率，最终 确定了拉长麦管为干细胞保存器具。 （3）利用配制好的冻存液和细胞悬液以2：1 混匀，然后转移到拉长麦管封口后直 接投入液氮，72 小时候从液氮灌取出，迅速放到37℃的恒温槽中，稳定一分钟左右取出， 加入台盼蓝染色，放到显微镜下拍摄图片，计算冻存后的存活率。改变冻存液配方，用 1%PVA 代替1%的蔗糖，然后冻存测量细胞存活率。 表1冻存液的各组分含量 编号 A组分质量 B组分质量 C组分质量 和细胞悬液2 ：1混合后 百分数 百分数 百分数 质量百分数