一步法TaqMan(R)探针实时荧光定量RT-PCR快速检测猪繁殖与呼吸综合征方法建立及初步应用.pdfVIP

第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集 ® 一步法 TaqMan 探针实时荧光定量 RT-PCR 快速检测猪繁殖与 呼吸综合征方法的建立及初步应用 1，2 1 1 1 1* 路斌 ，袁秀芳 ，徐丽华 ，李军星 ，王一成 (1. 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州，310021 ；2. 浙江省海盐县畜牧兽医局，浙江嘉兴，314300） 摘 要 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）的序列，设计了1 对特异性引物和1 条TaqMan®探针，建立了一步 法检测PRRSV 的荧光定量RT-PCR 方法。结果表明，建立的方法具有较高的特异性，与 PCV ﹑JEV ﹑SFV ﹑PRV ﹑ PPV 无交叉反应；可以检测到10 个拷贝数的模板RNA 或1 个TCID50 的PRRSV ，比常规RT-PCR 方法的灵敏度高10 倍；对同一样品进行４次重复试验，变异系数（CV）＜1%，具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR 和常规 RT-PCR 对72 份PRRS 疑似病例肺组织进行平行检测，结果荧光定量RT-PCR 检出40 份阳性，高于常规RT-PCR 方法 （28 份阳性）。本研究建立的荧光定量RT-PCR 方法特异性好、灵敏度高，而且快速简便，可用于PRRSV 的实验室快 速诊断和流行病学调查。 关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒；实时荧光定量RT-PCR ；建立与应用 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS ）是由猪繁殖与呼吸 综合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome Virus, PRRSV ）引起的猪的一种以发热、 厌食、流产、死胎、木乃伊胎及仔猪发生呼吸道症状为主的传染病[1] 。主要侵害机体免疫系统，形成 持续性的感染，并且常常与 CSFV、PCV2 等混合感染，给养猪业带来巨大损失。PRRSV 是一种含有 囊膜的正单股 RNA 病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，基因组全长约 15kb，由 9 个套叠的开放 阅读框组成，其中ORF1a 和 ORF1b 占了基因组全长75% 以上，编码病毒复制相关酶（非结构蛋白）， ORF2a ，ORFs3-5 编码膜相关糖基化蛋白；ORF2b 和 ORF6 编码膜的非糖基化蛋白；ORF7 编码核衣 壳蛋白。 [2] 1987 年在美国中西部城市北卡罗来纳州最先发现该病，俗称猪神秘病（MSD ） ；我国是在 199 6 年郭宝清等首次在暴发流产的胎儿体内分离到 PRRSV[3] 。目前，用于检测PRRSV 的方法有多种， 如病毒的分离鉴定、免疫过氧化物酶单层试验（IPMA ）、间接免疫荧光试验（IFA ）、酶联免疫吸附试 [4-6] 验（ELISA ）和血清中和试验（SN）、免疫胶体金技术、反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR ）等 。 虽然 ELISA 、SN 和免疫胶体金技术等简捷易操作，但敏感性低、特异性较差；病毒分离鉴定是病毒 性疫病诊断的最佳方法，但操作繁琐、检测周期长；荧光定量 PCR 方法是近年来在 RT-PCR 基础上发 展起来的一种分子生物学方法，具有快速、敏感、准确、定量检测微生物核酸拷贝数等优点。目前 R [7,8] eal-time FQ-PCR 已被广泛应用于基础科学研究、临床疾病诊断、疾病研究及药物开发等领域 。一 步法 RQ-RT-PCR 技术使 RT 和 RQ-PCR 在一个