HIV-2型重组蛋白的表达和其应用.pdfVIP

HIV．2型重组蛋白的表达及其应用 梁权 罗春贞 王 缦 上海科华生物工程股份有限公司，上海，200233 摘要 目的表达HIV-2型抗原片段，满足HIV体外检测研究的需要。方法从HIV一2 型外膜基因gp36抗原表位中筛选出三个优势抗原片段，利用DNA重组技术将三个片段基因 分别插入到表达质粒pET32a，使其在大肠杆菌BL。。DE3中表达。各重组蛋白经纯化后分别 包被微孔板，双抗原夹心ELISA检测HIV一2型抗体阳性血清和HIV抗体阴性血清。结论所 克隆的各抗原片段均获得高效表达，且一株重组蛋白经初步测定，具有较好的敏感性和特异 性，可用作进一步研究。 关键词 HIV；重组蛋白；表达 人类免疫缺陷病毒HIV—l和HIV一2，两型病毒ATTTAG一3’。各上游引物引入NcoI酶切位点，下 基因间的同源性为50％左右，抗原性差异较大[1]。游引物中引入XhoI位点。 感染HIV一1或HIV一2的患者，可产生针对病毒外4．基因扩增及纯化 以H2质粒为模板，加人 相应的引物、DNTP、LA 膜蛋白的体液免疫，产生的膜蛋白抗体具有型特异 Tag聚合酶进行PCR扩 性，而检测HIV的感染依赖于外膜特异性抗体的检 钟，共28个循环。收集各PCR产物，2％琼脂糖凝 测[2]，因此对HIV一2型外膜蛋白gp36的研究具有 重要意义。 胶电泳分离目的片断，用U—gene凝胶回收试剂盒 Ⅱ回收纯化。 材料和方法 5．表达载体构建 纯化后的各PCR产物经 Nco工和Xho 1．质粒和菌种表达质粒pET32a购自Nova— I酶切后，连人表达载体pET32a，构 gen公司；宿主细胞DH5a、BI，21DE3由本公司保 建克隆质粒Pl、P2和P3，分别将其转化到DH5a细 存；含HIV一2部分胞膜基因H2质粒由本公司保胞中，筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，并将其转 存。 化至BI。21DE3中。 2．主要试剂 中国药品生物制品检定所HIV 6．重组蛋白的表达与纯化 将含有重组质粒的 参考血清(批号南本公司保存；各种单抗各BL21DE3菌株接种于含有氨苄青霉素钠(50 1+2 由本公司生产并保存；HIV Elisa抗体检测试“g／m1)的LB培养基中，37℃培养过夜；次日，按 剂盒(以下简称HIVEI，ISAKit)由本公司生产并 保存。 度为lmmol／L，继续培养3小时。收获细菌，菌体 3．引物设计 根据HIV-2基因序列[3]相关资悬浮于PBS中(140mmol／LNaCl，10mmol／L · 料，借助PrimerPremier5．0生物软件设计三对Na2HP04 12H20，1．8mmol／LKH2PO¨ PCR引物。Pl克隆扩增上游引物P1F：5-GCGCC—2．7mmol／L KCL，pH7．5)，冰浴下超声破菌，取少 CATGGCACCAATTGGCTTCGCACCTC一3’，下量上清和沉淀进行12％SDS电泳。收取超 游引物P1R：5-CCGCCTCGAGTACAGTAGTGT— 声后的沉淀，按Qiagen公司的Ni-NTAAgaros纯 GGCAGACTTG-3’；P2克隆扩增上游引物P2F：化步骤进行包涵体蛋白的纯化。 5’一GCG