一个影响木材霉菌Fusarium+spp.菌丝生长重要基因克隆.pdfVIP

木材防腐新标准宣贯暨木材防腐产业发展研讨会论文集 一个影响木材霉菌F珊口^比m聊．菌丝生长的重要基因的克隆 马星霞1’2彭友良1蒋明亮2段新芳2 (1．中国农业大学植物病理学系，农业部分子植物病理学重点开放实验室，北京100094； 2．中国林科院木材工业研究所木材保护部，北京100091) 摘要：镰刀菌(尼sa一物印p)是引起木材霉变、蓝变的重要真菌。本研究以引起大小麦赤霉病的禾谷镰刀 菌菌株和引起马尾松等木材变色的串珠镰刀菌菌株为材料，采用基因敲除技术，把其中的一个真菌生长分化 的重要和保守基因敲除。该基因的敲除导致禾谷镰刀菌生长速度缓慢、产孢量下降、孢子形态发育不完善， 在大小麦中的致病力减弱，预测串珠镰刀菌该基因的敲除也将引起生长缓慢及对木材霉变力的降低。本研究 为木材腐朽茵、木材变色茵的分子生物学研究提供一些探索。 关键词：禾谷镰刀茵串珠镰刀菌基因敲除生长缓慢 删j-j国瑚f5)是引起木材霉变和变色的重要真菌。禾谷镰刀菌基因组大小40MB，4条染色 体。串珠镰刀菌菌基因组大小约为46皿，12条染色体，2003年5月禾谷镰刀菌菌株PH一1及 该菌的功能基因组学奠定了基础。 Mg鹏P1是稻瘟菌中生长分化的一个重要基因，基因芯片结果显示：该基因可能是真菌细 胞周期中的一个重要的转录因子|。‘，酵母中该同源基因的研究显示：该转录因子的调控在子囊 菌酵母中具有高度保守性，在动物与植物中都有存在，其在sTART期的调控可能是整个真核生 物细胞周期的普遍特征一。禾谷镰刀菌中该基因与稻瘟菌Mg船P1氨基酸一致性达到50％。。 本研究以引起大小麦赤霉病的禾谷镰刀菌菌株和引起马尾松等木材变色的串珠镰刀菌菌株为 材料，采用基因敲除技术，把此影响真菌生长分化的重要和保守基因敲除。该基因的敲除导 致禾谷镰刀菌生长速度缓慢、产孢量下降、孢子形态发育不完善，在大小麦中的致病力减弱。 串珠镰刀菌中该基因与禾谷镰刀菌蛋白一致性高达88．31％，预测串珠镰刀菌该基因的敲除也 将引起串珠镰刀菌生长缓慢、木材霉变力降低。 1材料与方法 1．1供试材料 1．1．1供试菌株野生型禾谷镰刀菌菌株Gz(或fg)(南京农大提供)，野生型马尾松变色菌 串珠镰刀菌菌株(国家林业局菌种保藏中心提供) 1．1．2供试大麦品种早熟3号、鄂大麦7号、鄂大麦9号和米麦，供试小麦品种为苏麦3 一123． 木材防腐新标准宣贯暨木材防腐产业发展研讨会论文集 种，每品种播种2行(由湖北省农业科学院植保土肥研究所完成)。 JR 博士惠赠，带有新霉素磷酸转移酶基因)；pUCl8、pBlueScriptKS}、pGEM7zf(华美公司) 等。 1．1．4大肠杆菌感受态菌株DHl0B、JMl09等。 1．1．5试剂盒胶回收试剂盒，，随机引物标记试剂盒等购白大连TaKaRa和北京赛百盛公司。 1．1．6抗生素G418，美国AIIlresco公司生产，潮霉素B，美国Roche公司生产。 1．1．7其它工具酶和生化试剂分别购白上海生工，北京欣经科公司，北京化学试剂公司等。 1．1．8培养禾谷镰刀菌所用培养基 (1)马铃薯培养基(PDA)：将削皮土豆2009在适量水中煮沸lO分钟，纱布过滤后加 入15—259蔗糖，固体培养基则加入16—189琼脂，定容1L，高压灭菌15分钟备有。 (2)摇培镰刀菌孢子用4％绿豆汁培养基：49绿豆在适量水中煮至刚刚开花，过滤定 容至100ml。 (3)固体和液体完全培养基(CM培养基)配方O．6％酵母提取物，0．3％酶水解干酪 素，0．3％酸水解干酪素，1％蔗糖，1．6％琼脂。 1．2实验方法 1．2．1基因敲除原生质体转化法 1．2．2镰刀菌基因组DNA的提取(CTAB／NaCl法) 1．2．3基因组southern杂交参见一般分子生物学实验方法 1．2．4禾谷镰刀菌菌落生长状况的比较将单孢菌落用5唧打孔器打下菌饼接种于PDA培养基 平板上，26℃左右光照培养，3d后测量菌落直径，减去原始菌饼直径作为实际扩展直径。