鸡CaBP-D28k基因重组质粒构建.pdfVIP

浙江大学学报 (农业与生命科学版) 34(6)：608～614，2008 JournalofZhejiangUniversity(Agric．8LI．ifeSci．) 文章编号 ：1008—9209(2008)06—060807 DOI：10．3785／jissn．1008—9209．2008．06．004 鸡 CaBP-D28k基因重组质粒构建 俞 路 ，王雅倩 ，章世元，李燕舞，李治学 (扬州大学 动物科学与技术学 院，江苏 扬州 225009) 摘 要 ：为构建 pCEP4一CaBPD28k真核表达载体 ，根据 GenBank已发表钙结合蛋 白D28k(calbindiw D28k，CaBP-D28k)设计 l对引物 ，利用 RT—PCR方法获得新扬州鸡 CaBP-D28k基 因序列，克隆入真核 表达载体 pCEP4，经 PEI介导转入非洲绿猴转化 肾细胞(COS—1)中，并以间接免疫荧光试验 (IFA)检测 CaBP-D28k表达状 况．结果表 明，CaBP-D28k基 因核 苷酸长度为 789bp，编码 261个氨基 酸，与 GenBank上 已发表序列 比较 ，核苷酸同源性为 99．9 ，在第 760位处存在 G—T 的错义突变 该序列与 蟾蜍 、鼠、人 CaBP—D28k氨基酸 同源性分别为 79．7 、78．2 、78．6 ；酶切和测序鉴定证 实 pCEP4一 CaBP—D28k含有 目的片段，且连接构建正确；在 COS一1细胞q-检测到CaBP-D28k表达．这为进一步研 究pCEP4CaBP—D28k在动物体 中的表达 ，调控机体钙代谢奠定了基础． 关 键 词 ：鸡 ；CaBPD28k；基 因克隆；表达载体 ；间接免疫荧光 中图分类号 ：$831．2；Q78 文献标识码 ：A YU Iu．WANG Yaqian，ZHANG Shi—yuan，LIYan—wu，LIZhi—xue(CollegeoJAnimalScienceand Technology，YangzhouUniversity，Yangzhou，Jiangsu225009，China) Constructionofrecombinantplasmidofchickencalbindin-D28k．JournalofZhejiangUniversity(Agric． IifeSci．)，2008，34(6)：608614 Abstract：Toconstructtheeukaryoticexpression vectorofpCEP4一CaBP—D28k，apairofprimerswas designedaccording to chicken calbindiwD28k (CaBPD28k) gene sequence published in GenBank． ChickenCaBP-D28k genewasamplifiedbyRT PCR from chickenintestinetotalRNA extractsandwas clonedintoeukaryoticexpressionvectorpCEP4，andtransferredintoCOS 1，Thegeneexpressionwas detectedby indirectimmunofluorescentassay (IFA)．Theresultshowsthatthecloned CaBp-D28k gene，encoding261aminoacids，was789bpinlengthwhichwas99．9 identitybutonlyonenucleotide changedfrom G to T atsite 760 compared with published sequence from GenBank database．The homologyofCaBP-D28k genesequencebetweenchickenandotherspeciessuchasfrog，housemouse， human was79．7 ，78．2 ，78