制备抗氧化大豆肽用酶的筛选.docVIP

制备抗氧化大豆肽用酶的筛选 黄纪念1，豆康宁2，郑学龄2（1 河南省农科院农副产品加工研究所，郑州? 450002； 2 河南工业大学粮油食品学院，郑州? 450052） 摘? 要：本文研究了由碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白酶制备的大豆肽的抗氧化值大小，结果表明，大豆肽的氧化值大小与酶的种类和水解度的大小有关，以抗氧化值大小为指标，筛选出碱性酶为最佳用酶。关键字：大豆肽；蛋白酶；水解度；抗氧化值 近年来研究发现，大豆肽在体外具有抗氧化活性。Chen等［1］发现大豆蛋白酶解物具有抗亚油酸脂质过氧化作用；张学忠等［2］发现在邻苯三酚自氧化反应体系中添加40mg/ml大豆多肽，邻苯三酚自氧化速率被抑制27%，这说明大豆蛋白酶解物具有清除超氧阴离子作用；陈美珍等［3］研究发现大豆分离蛋白酶解物具有清除羟自由基的能力，其清除能力主要与暴露的氨基酸侧链基团和肽序列有关。抗氧化大豆肽在保健食品方面应用前景广阔，开展制备抗氧化大豆肽用酶的筛选研究具有重要的理论价值和应用前景。1? 材料与方法1.1? 材料与试剂大豆分离蛋白，由郑州同创益生食品有限公司提供；碱性蛋白酶（2.4AU/g）、风味复合酶（500LAPU/g）、复合酶（1.5AU/g），由Novozyme提供；木瓜蛋白酶（60万u/g），由广西南宁杰沃生物制品有限公司提供；菠萝蛋白酶（2500GDU），由广州丰天化工有限公司提供；胃蛋白酶（1∶10000）、胰蛋白酶（250.U.F.U/mg）、亚油酸（分析纯），由Sigma提供；磷酸缓冲液（pH9.35）、FeCl2-EDTA溶液（0.05mol/L）、FeCl2溶液（0.1mol/L）、KSCN（40%）、乙醇（75%，含0.3mol/L HCl）、茚三酮显色试剂、甘氨酸溶液（含氮量5ug/ml）、1mol/LNaOH溶液、2N? HCL溶液等。1.2? 仪器紫外可见分光光度计，超声波清洗机，离心分离机，pH酸度计，凯氏定氮仪，增力电动搅拌器，电热恒温水浴锅，恒温干燥箱。1.3? 实验方法1.3.1? 氮含量测定凯式定氮（GB/T5009.5-2003）。1.3.2? 大豆肽溶液制备配制4%（W/V）的大豆蛋白溶液，迅速加热至80℃，经80℃水浴保温热处理10min后冷却至酶最佳水解温度，保持温度和搅拌速度不变，同时用NaOH（HCl）标准溶液调节溶液pH值至酶解最佳pH值。按比例称取蛋白酶加到大豆蛋白溶液中，开始计时，在反应过程中及时加入NaOH（HCl）标准溶液维持pH值不变，到预定的反应时间提取一定体积的溶液，然后迅速升温到85℃灭酶活10min，冷却后，以5000r/min离心分离10min，取其上清液测定水解度和抗氧化值。1.3.3? 水解度测定［4］h=（A×10-3×10）/（14×0.1）=A/14（mmol/ml）ho=4%×7.75=0.312?????????????????????????????? （mmol/ml）DH（%）=h/ho=23A????????????????????????????????????????? （1）注：h:大豆肽溶液中-NH2的浓度（mmol/ml）ho：蛋白质溶液肽键当量浓度（mmol/ml）A：大豆肽溶液氮浓度（ug/ml）1.3.4? 蛋白酶水解参数的确定影响蛋白酶水解速度和蛋白质水解度的参数主要有温度、pH值、底物浓度、酶浓度、时间。以水解度为指标，先用单因素试验确定参数的最佳值，然后用正交试验优化因素组合，从而确定蛋白酶水解参数。1.3.5? 大豆肽抗氧化值测定［5］大豆肽抗氧化值测定参考文献［5］，并作了适当修改：在小锥形瓶内放入10ml亚油酸储备液，300ml0.05mol/L的FeCl2-EDTA溶液，500ul大豆肽溶液，混匀在暗处50℃保存4h，然后取出1000ul，加入200u10.1mol/L的FeCl2溶液，再加入1000ul的40%KSCN溶液，混匀后取出130ul放入干试管中，再加入6ml乙醇（75%，含0.3mol/L HCl），混匀后反应5min，再测定该混合液481nm下的吸光值。以未水解的大豆蛋白反应溶液的吸光值作为空白值，它的相对抗氧化值为1。相对抗氧化值=未水解蛋白溶液的吸光值/大豆肽溶液吸光值2? 实验结果2.1? 含氮量标准曲线用分光光度计（580nm）测得不同浓度甘氨酸工作液的吸光值见图1。含氮量与吸光值的回归方程为：y=1.3342x+0.0133?????????????????? （2），回归系数为R2=0.998。方程（2）的反函数为x=0.425y-0.0095（3），把方程（3）中的x值代入公式（