米糠多肽的提取(潘艳艳).docVIP

米糠多肽的提取 潘艳艳 1、原理 蛋白质的酶法水解就是利用蛋白水解酶在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解，是蛋白质大分子降解成不同链长的小分子。与酸碱催化的水解反应相比，它的反应条件温和，副反应少。中性蛋白酶是巯基蛋白酶，作用底物广泛，对Gly、Arg、Lys、Phe等氨基酸形成的7种肽链有断裂作用，同时也具有一定的脂酶能力。由于米糠中存在一些抗中性蛋白酶的“抑制因子”，以及米糠蛋白的高度结构比，形成坚实的球形结构，使中性蛋白酶对米糠的水解作用较差。 2、材料和仪器 2.1 主要试剂 脱脂米糠，要求新鲜、无霉变，干净。 As1.398中性蛋白酶，测得酶活力为13.0万U/g，氢氧化钠，柠檬酸，正己烷，亚硫酸钠。 2.2主要设备 超级恒温器，恒温水浴锅，强力电动搅拌机，鼓风干燥箱，离心机，天平，量筒，旋转蒸发器，真空泵，微量凯氏定氮仪，PH-STAT装置，HPLC(高效液相色谱)。 2.3测定方法 2.3.1脱脂米糠中各组分的测定 蛋白质测定方法 GB5511 水分测定方法 GB5491 粗脂肪测定方法 GB5512 粗纤维测定方法 GB5515 2.3.2酶活力的测定 福林-酚法 2.3.3蛋白质水解度的测定 测定公式W(%)=(N2-N1)/(N0-N1)*100 N0:脱脂米糠蛋白中的总氮量。 N1：酶解前脱脂米糠蛋白溶液在10%TCA中的可溶性氮量。 N2：酶解后酶解液在10%TCA中的可溶性氮。 式中的氮是由微量凯式定氮法测定。 2.3.4三氯乙酸（TCA）可溶性氮测定 量取蛋白水解液10ml，加入10%三氯乙酸10ml与之混合，放置20min后，在4000r/min下离心15min,用凯式定氮法测定上清液的可溶性氮浓度。 3实验方法 3.1工艺流程 脱脂米糠→ 粉碎→ 烘干→ 浸出→ 碱溶→ 酸沉→ 煮沸→ 冷却→ 酶水解→ 灭活→ 脱色→ 抽滤→ 真空干燥→ 脱脂米糠多肽 3.2工艺操作 3.2.1粉碎与烘干 先用铁锤和扳手把大米糠敲成绿豆大的小块，再用粉碎机粉成粉末。将粉末放入烘箱里烘2小时。 3.2.2浸出 脱脂米糠粉在50℃条件下，用正乙烷浸提8小时。取出粕放入通风橱中，待正乙烷自然挥发后用于实验。 3.2.3碱溶，酸沉 称取100克脱脂米糠粕加入1000毫升蒸馏水，用3摩/升的氢氧化钠调PH为9.0左右，在50℃的恒温水浴锅中搅拌2小时，然后以1500转/分的速度离心分离10分钟，去下层渣，留上层清夜。用3摩/升的柠檬酸将上层清夜PH调为4.5，然后以1500转/分的速度离心分离10分钟，去上层清夜，留下层蛋白质沉淀。 3.2.4煮沸 将所得蛋白质沉淀溶于500毫升水中，将其放入100℃的恒温水浴锅中加热30分钟。 3.2.5冷却与酶解 将上述溶液降温至37℃，然后放入恒温水浴锅中，加入一定量的亚硫酸钠，调PH为7.0左右，且要不停的搅拌，酶水解3小时，停止酶解。 3.2.6灭酶 水解液中加入柠檬酸，调节PH=4.0到4.5，使酶失活，冷却。将水解液放入离心机中，以1500转/分的速度离心10分钟，去下层沉淀，留上层清夜。 3.2.7脱臭脱色 将上述溶液中加入其重量5%的活性碳，在30℃的水浴锅中保持3.5h且持续搅拌。将此液用循环水真空泵抽滤得水解蛋白质的清夜，即多肽溶液。 3.2.8浓缩干燥 将上述清液放入真空浓缩器中真空浓缩，三小时后得成品。 3.3操作要点 3.3.1碱溶酸沉 碱溶时控制PH在9.0是为了使蛋白质更充分的溶出，酸沉除去了脱脂米糠蛋白中可溶性纤维、糖分、脂肪、矿物元素等。这对脱脂米糠多肽的纯度至关重要。 3.3.2煮沸 将蛋白质变性，从而使蛋白质能更好的被酶水解，增大水解程度。而且变性蛋白质比没有变性的消化效果要好些，其操作最主要的就是要控制温度。本实验要求在100℃左右，加热30min就能使蛋白质充分变性。 3.3.3酶解过程 这个过程主要将蛋白质水解，酶作为催化剂，它的反应条件要求很高，因此主要控制PH值，水解过程中边搅拌边滴加氢氧化钠保持PH恒定。同时，也要控制温度的恒定，从经济角度也要注意酶的用量及反应时间的控制。 3.3.4灭活 水解完后，降低PH至4.0到4.5，此条件下，所加的蛋白酶不可逆的失活。而在PH4.0到4.5时，苦味很强的中肽是不溶的，被离心分离除去，因此苦味降低。 3.3.5脱色脱臭 这个过程主要是除去产品的一些色素、臭味物质，从而来改变产品的色泽等感官性能，但在脱色的时候要尽量使脱色剂和产品溶液混合均匀，来增加脱色效果。此过程对去除质白质水解物的苦味有很重要的作用。蛋白质的水解物之所以带有苦味是因为疏水性多