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鲜奶中四环素类药物残留检测方法建立——高效液相色谱法 近年来，由于在奶牛饲料和治疗中广泛应用到了四环素类抗生素(TCs)，从而引起牛奶中TCs的残留。长期食用含TCs的牛奶会危害人体健康，因此应严格控制畜禽肉中TCs的残留量。本文在参考国内外检测方法的基础上，建立了用液相色谱法测定鲜奶中四环素类抗生素残留量最佳方法，填补了我单位这方面工作的技术空白，可为牛奶样品中四环素类药物及其代谢产物残留的监督检验和残留监控提供技术支持。 1．仪器与试药 戴安公司高效液相色谱仪（带可变波长紫外检测器），漩涡混合器，超声波仪，离心机，氮吹仪。 土霉素(0TC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)标准储备液配制：准确称取0TC、TC、CTC 固体标准品各0.01g，用0.1mol/L盐酸溶解，并用甲醇定容至10mL，此三种标准储备液含量为1mg/mL (4℃下可保存一周)。 混合标准溶液：取0TC、TC标准储备液各1mL，CTC标准储备液2mL，用甲醇定容至1O ml，此混合标准液中OTC、TC含量分别为100μg／ml（ppm），CTC含量为200μg／ml（ppm） (当天配制当天使用)。 Mcllvalane-EDTA缓冲溶液配制：分别称取1水柠檬酸11.8g,12水磷酸氢二钠27.6g，12水乙二胺四乙酸二钠37.2g，溶于1L水中，用盐酸调节PH至3.8。 0.01mol/L磷酸二氢钠溶液配制：称取1.56g磷酸二氢钠溶于100 mL水中，用30%硝酸调节PH至2.5，经微孔滤膜过滤，超声备用。 2、色谱条件 色谱柱：安捷伦ODS-C18,4.6×250mm，5μm；预柱：C18微柱；流动相:乙腈+0.01mol/L磷酸二氢钠溶液=27+73；流速：0.8 mL／min检测波长：355 nm；柱温：室温；进样量：2OμL。 3、实验步骤 样品测定：取2mL鲜奶样品，加入50 mLMcllvalane-EDTA缓冲溶液，漩涡混合1min,低温超声10min，转移至50 mL聚丙烯离心管中，冷却至4℃，以5000r/min的速度离心10min（温度低于15℃），过滤，取5mL上清液过C18微柱（先用3mL甲醇，2mL水预洗），用1mL水洗涤小柱并挤干，最后用2mL甲醇洗脱，洗脱液经氮吹仪吹干后用甲醇+水（浓度比为30：70）溶解，过0.45μm滤膜，取20μL进样，记录峰高，从工作曲线上查得含量。 工作曲线：分别取7份2 mL牛奶空白样品，每份分别加入混合标准溶液0、25、50、100、150、200、250μL(含土霉素、四环素各为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg，含金霉素各为0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg)，按3的方法操作、以峰高为纵坐标，以抗生素含量为横坐标，绘制工作曲线。 回收率及精密度试验：分别向5mL空白牛奶样品中添加混合标准溶液制成0.05、0.1、0.2μg／ml 3种浓度的标准回收溶液，按上述样品处理和色谱条件进行回收率及精密度试验(每个添加做5个平行)， 4、结果 用上述色谱条件，在O～10μg／ml范围内，OTC、TC、CTC 线性关系良好，相关系数r0．99。OTC、TC、CTC的出峰时间分别为4.019min、4.337min、6.735min，能达到快速分离的要求。测得平均回收率在在84.7%~101%之间，相对标准偏差在1.7%~6.2%之间，均满足国内外对残留分析的要求，表明该方法准确可靠。应用本方法检测了多批次鲜奶样品，结果表明方法具有灵敏高、选择性强、简便、快速等优点。方法的检测限能达到20 μg/kg，达到了检测四环素类抗生素残留的国标要求（100μg/kg），可用于牛奶样品中四环素类抗生素及其代谢产物多残留的同时确证检测。