丹参脱病毒技术的研究.pdfVIP

丹参脱病毒技术研究 温誊秀，谢晓壳，美志甓 (河北省农林科学院药用植物研究中心，石家庄050051) 山东等地发现，有一种引起丹参退化的丹参花叶瘸，该病田问发病率高，有些田块竟高达60-80％， 表现爻筏盱、褒驳、卷睦、黄化、矮纯等英壅症状，感瘾蕴株鳇棱系绷小，药建成分含量降低，严重 影响了丹参的产量利品质。本研究就是针对该病毒进行检测鉴定，确定病毒种类，并采用热处理与茎 尖培养相结合的方法脱除该瘸毒，获得了丹参脱病毒原种；建立起了丹参脱毒菌快繁技术体系，为生 产上块遽推广优炎耩菌和丹参G般建设提餐技术依托。 1材料与方法 l。王材料 丹参花叶病瘸害植株采于河北省农林科学院药用植物研究中心实验基地。 1．2试剂 IRA、NAA以及琼脂、蔗糖等购自华美生物工程有限公司。 1．3方法 1．3．1 生物学接种按常攥汁液摩擦接稀法，将丹参謦病毒酶叶片汁滚接种裂融肋烟、兰生烟、心 叶烟、蔸色黎4种指示植物上，3次重复，然后罩上防虫网培养，30d后观察病毒症状反应。 l。3．2 电镜观察检、冽黄瓜花叶病毒的提纯采用裴美云等的方法。复染采用2％的醋酸铀，然后进行 电镜毳察，拍照。 ’ 1．3．3DAS—ELISA检测CMVDAS—ELISA检测过程按照其说明书进杼，酶联仪上信号检测选用临界 值进行，滤光片选用405nm。 1．3。4接种诱导芽体再生惩常裁的方法接静丹参根段予不定芽诱导培养基上，诱导不定芽产生， 获得不同种质类别的丹参试管苗。 l。3．5热处理、切取茎尖将丹参试管瓶菌星予光照垮养瓣中，在温度先37--38℃、湿度80％、光 无菌条件下切取0．2～O．4嘲大小的萎尖。茎尖接种于培养基：l／3MS+BA1．0mg／L／IBA0．02mg ／L上培养，培养滠度(254-1)℃，光强2000一--3000Lx，光照时间12 h／d，褥到待检测的丹参小植 株。 待检小植株进行检测，检测结果在酶链免疫仪上读数确定。 1．3。7培养条件以醛为培养基，附加不冠浓度的生长素和细胞分裂素，琼脂0．7％，p珏5．8， 其中分化培养基(见表6)含3％蔗糖，生根培养基(见表7)含2％的蔗糖。培养基分装后在121℃下灭 菌15min。培养滠度(25±1)℃，光强2000一--3000Lx，光照对闻12h／d。 2结果与分析 2．1生物学鉴定 我们在河托、山东等地对丹参进行了实地系统调查，观测到田闻典型病毒症状的病叶及丹参植株， 表现典型的花叶(图1)、植株矮化及叶片褪绿黄化畸形等癜(图2)。 119 豳1花叶症状 圈2矮化褪绿畸形症状 2．2’电镜撬察 电镜放大倍数为30000倍，V表示视野中的病毒粒子(紧靠予V字左边)，观测副的粒子经测量比 较，其直径约为29～30nm(如图3)，与CMV病毒球形粒子相近，电镜视野中未见线状及杆状病毒。 鄹3病毒救体观察 2。3 DAS-ELISA检测 为样品剐性。l，2，3表示酶联叛歹g数，A，B，C，D，嚣，F，C，ll表示酶联板的行数，共24个孔。B1， Phos 82，B3孔表示空自对照，实验过程中不加入二抗(矗IkEnzyme 示阴性对照，实验过程中抗原采用健康烟革叶片研磨液，H1，I{2，H3表示刚性对照，实验过程中抗原 采用试裁盒阳性研磨液；其余15个孔，实验过程中抗原采用酬阕采集的丹参叶片，其他各个步骤葙 鬻。N表示阴性对照数据，群+舻表示阳馁结果，群一一表示戮性结果。 OdV 表l DAS-ELISA检酒结聚 A B C D E F G 鞋 1 + 一 一 一 + + 一 + 2 +