艰难梭菌A毒素单克隆抗体酶标诊断试剂盒研制.pdfVIP

艰难梭菌A毒素单克隆抗体酶标诊断试剂盒的研制 广州第一军医大学南方医院全军消化病研究所(510515) 傅思武周殿元赖卓胜潘令嘉 艰难梭菌是人与动物伪膜性肠炎(Pseudomem-4．抗体纯化：(1)将克隆化后的细胞株扩增培 branous colitis，PMC)和抗生素相关性腹泻的主要病养，以l旷／ml浓度注射预先用福氏不完全佐剂致敏 原菌，该菌可产生至少两种毒素，A毒素为肠毒素，B 的BALB／C小鼠，每只0．5ml，8d后处死小鼠收集 mmol／LPBS 毒素为细胞毒素，A毒素可导致肠黏膜出现血性积 腹水，离心、50％饱和度硫酸铵盐析、10 液和细胞毒性，B毒素对许多组织培养细胞都有很 S一300层析纯化。(2)家兔 (pH7．4)溶解，Sephaeryl 强的毒性。 血清稀释、50％饱和度硫酸铵盐析、35％饱和度硫酸 mmol／L 在艰难梭菌感染的诊断研究方面，许多免疫检 铵盐析3次，10 7．4)溶解离心沉淀， PBS(pH 测中常使用多克隆抗体，由于多克隆抗体除含有针 S一300层析纯化。 Sephacrxl 对A、B毒素的抗体外，也含有其他的抗体，因此，不 5．酶标记单克隆抗体：采用改良过碘酸钠氧化 可避免的使诊断结果有一定的假阳性存在，这样，用 法，5zng辣根过氧化物酶(sigm)用灭菌去离子水溶 单克隆抗体来替代以前所使用的多抗毒素有望提高 解，加人0．3IIll0．1mol过碘酸钠溶液，4℃搅拌30 ELISA诊断试剂的特异度，从而降低假阳性。本研min，用0．01mol乙酸盐缓冲液(pH4．4)4℃透析过 究旨在利用艰难梭菌A毒素单克隆抗体来制备 夜，加入0．16mol／L的乙二醇0．5IIll，混匀，4℃、1h， 滴加1r,a(5 tool碳酸盐缓 ELISA诊断试剂，为艰难梭菌临床感染的诊断提供 mg／lIll)IgG，混匀后用0．05 可行的方法。 9．5)4℃透析过夜，然后用0．2111l(5rag／m1) 冲液(pH 的硼氢酸钠还原未结合的酶，4℃，3h，用50％饱和 材料和方法 h，离心收集沉淀并透析于 度的硫酸铵盐析，4℃，2 100mmol 1．菌种及培养：本试验采用菌株共49株，包括 PBs(pH7．4)3IIll。测定蛋白含量，酶结合 2株艰难梭菌产毒株、2株艰难梭菌非产毒株、26株率，最佳工作浓度。加入等体积甘油置一20℃冰箱 大肠埃希菌、2株痢疾杆菌、1株双歧杆菌、5株霍乱 保存。 弧菌、2株伤寒沙门氏菌、7株肉毒梭菌、1株索氏梭 6．ELISA：采用双抗体夹心法，(1)包板，每孔加 入100 菌、1株酪酸梭菌，各菌均按各自最适培养基及条件