共表达蛋白质折叠辅助因子对毕赤酵母分泌表达IFNβ-HSA融合蛋白质的影响.pdfVIP

陈凤祥 ，等 ：共表达蛋 白质折叠辅助 因子对毕赤酵母分泌表达 IFN3[一HSA融合蛋 白质的影响 recombinantswith no effecton growth．Compared with Bip，CO-expressed with Ero1and PDI significantlyimprovedtheexpressionlevelofIFN[3-HSA，theexpressionlevelwas80％(Ero1)and 90％(PDI)higherthancontro1． Keywords：proteinfoldingfactor，IFN3[一HSA，Pichiapastoris，Ero1，PDI，BiP 干扰素 B(Interferonp，IFNI3)是 由人成纤维细 表达水平 的影响。 胞分泌 的一种糖蛋 白质 ，它是一种具有广谱抗病 毒 、抑制细胞增殖 、免疫调节等多种生物活性 的细 胞 因子 ．由 166个氨基酸残基组成 ．相对分子质量 为 22000～23000[1-21。由于 IFN3[相对分子质量较 1．1 菌株和质粒 小 ，易被肾小球滤过 ，因而在体内的半衰期较短。作 融合 蛋 白质表达 菌株 PichiapastorisGS115／ 者所在实验室前期利用基 因融合技术将 IFN[3与人 pPIC—IFN3[一HSA和蛋白质折叠辅助因子表达载体 血清 白蛋 白质 (Humanserumalbumin。HSA)基因融 pGAP—Ero1、pGAP—PDI、pGAP—BiP由作者所在实验 合 ，并成功地在毕赤酵母 (Pichiapastoris)KM71中 室构建并保 藏 ，酵母表达载体 pGAPZB购 自 进行了表达 ．融合蛋 白质具有 HSA和 IFN3[的抗原 Invitrogen公司。 性 以及 良好的临床应用前景3【1。 1．2 主要试剂 研究表明．外源蛋 白质过量表达时 ，初生肽链 限制性 内切酶AvrII，购 自Thenno公司；PCR产 在 内质网中折叠 、加工和转运途径超载 ，造成蛋 白 物纯化试剂盒 ，购 自生T生物工程 (上海)股份有限 质错误折叠 ，成为外源蛋 白质分泌表达的限速步 公司；酵母基因组提取试剂盒 ，购 自北京康为世纪 骤4[1。分子伴侣 BiP是定位于内质 网腔内的伴侣蛋 生物科技有限公司 ；酸洗玻璃珠 (500 m)，购 自 白质 ，能帮助新合成蛋 白质完成进一步的折叠 ，或 Sigma公司；博来霉素 (Zeocin)，购 自美国 Invitrogen 者与未折叠蛋 白质 、错误折叠蛋白质结合并通过内 公司；酵母浸粉 (YeastExtract)、胰蛋 白胨 (Tryptone 质网相关的降解 (ERassociateddegradation，ERAD) Powder)，购 自OXOID公司；其它试剂均为进 口或国 途径实现其降解l5。有文献报道 ，共表达分子伴侣 产分析纯 BiP能够促进毕赤酵母分泌外源蛋 白质[刀；但也有研 l-3 共表达转化子的构建与验证 究表明，BiP的过量共表达会对外源蛋 白质表达造 将 pGAP—Ero1、pGAP—PDI和 pGAP—BiP共表 成负面影响嗍。分析其原因可能是过表达 BiP将导 达质粒和 pGAPZB空载分别用AvrII限制性 内切 致其辅助分子伴侣 Lhslp或内质 网腔 内ATP等含 酶进行线性化 ，电击转化 GS115一IFNI~-HSA感受态 量不足 ．过多的BiP不再能发挥分子伴侣活性 ，从 细胞 (1．5kV、5ms)t41。加入预冷 的 1mol／L山梨醇 而使蛋白质进入 ERAD途径而被 降解 01。 30℃静置培养 1h后 ，再加入 YPD培养基 30℃振 二硫键异构酶 (PDI)能够加速对蛋白质的进一 荡培养 2h，涂布 YPD平板 (含 400 g／mL的 步折叠 ，主要负