阴道非白念珠菌的PCR-RFLP鉴定76561.pdfVIP

阴道非白念珠菌的PCR–RFLP 鉴定 武燕，骆志成，武三卯，白瑛，魏玉平，牛桃香 兰州大学第二医院皮肤性病科，甘肃兰州（730030 ） E–mail ：wuyan2005st@126.com 摘 要：目的 对分离自外阴阴道念珠菌病（VVC ）患者阴道的常见致病性非白念珠菌进 行PCR–RFLP 鉴定。 方法 首先采用芽管试验、厚壁孢子试验、CHROMagar 显色培养基 及API 试纸条将分离自VVC 患者阴道内的念珠菌菌株鉴定到种，然后采用真菌通用引物将 4 种常见非白念珠菌（包括光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和热带念珠菌）进行PCR 扩增，并选用Msp Ⅰ、HaeⅢ两种内切酶对扩增产物进行酶切分析。 结果 在 4 种非白念 珠菌中光滑念珠菌 15 株（7.5 ％），近平滑念珠菌7 株(3.5%) ，克柔念珠菌5 株(2.5%) ，热带 念珠菌2 株(1.0%)；PCR 扩增后均产生稳定、清晰的条带，扩增产物经Msp Ⅰ、HaeⅢ酶切 后分别产生4 种和2 种特异性带型。 结论 外阴阴道念珠菌病非白念珠菌中以光滑念珠菌 为主；PCR–RFLP 可以快速、特异的鉴定非白念珠菌。 关键词：非白念珠菌；聚合酶链反应；多态性，限制性片段长度 外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis ，VVC ）是一种常见的由念珠菌感染引起的 阴道炎。近年来发病率呈明显上升趋势。尽管以往研究认为阴道念珠菌感染的病原体 85%-90%为白念珠菌[1]，但随着念珠菌感染率的上升，抗真菌药物的滥用，念珠菌致病菌种 的分布及耐药性均发生了变化。除白念珠菌外，非白念珠菌包括光滑念珠菌（C.glabrata）、 克柔念珠菌（C.krusei）、热带念珠菌（C.tropicalis）、近平滑念珠菌（C.parapsilosis）的比例 和耐药株的发生率呈现不同区域不同程度的增加[2] 。一些罕见菌种如都柏林念珠菌 （C.dubliniensis ）等也有引起感染的报道[3] 。本研究对临床分离出的非白念珠菌进行 PCR–RFLP 鉴定，为临床实验室建立更加快速、准确的非白念珠菌感染的诊断和鉴定方法提 供依据。 1. 材料和方法 1.1 临床菌株来源与采集： 来自2007 年 1 月-12 月在兰州大学第一医院、兰州大学第二医院皮肤科和省妇幼保健 医院妇产科门诊就诊的患者，均符合VVC 的诊断标准。使用一次性无菌阴道棉拭子在阴道 后穹隆处取适量阴道分泌物于载玻片上，以10%氢氧化钾溶液悬滴镜检，观察到菌丝和（或） 孢子为镜检阳性。 1.2 菌株培养与鉴定： 镜检阳性标本接种于沙堡氏培养基（SDA ）各两管，置 30℃恒温培养箱内培养，选择 阳性菌落进行3 次分离纯化，并经芽管试验、厚壁孢子试验、CHROMAgar 显色培养初步鉴 定为非白念珠菌（non-Candida albicans）。然后采用API 20CAUX 将所有标本鉴定到种的水 平。 1.3 模板DNA 制备： 采用微波破壁微法。简要步骤如下：将念珠菌单菌落接种于 5mL 沙氏液体培养基中， 28 ℃水浴振荡培养48h 。收集酵母菌落，离心，弃菌液，加入100µL 的DNA 裂解液（50mM Tris-HCl，pH7.2;50mM EDTA;3%SDS;1%2-巯基乙醇）。置微波炉处理三次，每次10 秒；再 - 1 - 加入300µL 裂解液，混匀，80℃水浴5min；加入等体积的酚氯仿，混匀，离心；取上层水 相，加等体积氯仿再次抽提，取上层水相，加等体积异丙醇，0.1 体积3mol/L 的乙酸钠，离 心，弃上清液，加200µL 80% 的乙醇，离心，弃上清液，干燥，加入50µL TE，于-20℃保 存。 1.4 PCR 扩增： 50µL 体系：其中 DNA 模板（约 10-100ng ）2 µL ，真菌通用引物 ITS1:(5′–TCCGTAGGTGAACCTGCGC–3′,10µM/L) ， ITS4 ：（