诱变物质微核检测技术.docVIP

诱变物质的微核检测技术 （2）通过检测评价环境中常见物质的诱变情况。 2.2实验原理 微核是真核细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。在细胞间期微核呈圆形或椭圆形，游离于主核外，大小应在主核1/3以下，微核测试是一种以染色体损伤及纺锤丝毒性等为测试点的微核检测方法，用微核率大小表示诱变因子强弱，经证实微核率大小和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关。 引起染色体断裂的因素按作用可分为断裂剂和非整倍体剂：断裂剂和诱发染色体断裂，非整倍体剂可使染色体和纺锤体联结发生障碍或纺锤体功能受损。引起染色体断裂的因素按来源可分为物理因素和化学因素。物理因素包括：具有能量的各种射线，如α射线，β射线，γ射线， X-ray ，中子，质子，UV等。化学因素包括：诱变剂和重金属等。经典断裂剂：Ｘ射线。诱变剂：环磷酰胺、氧化铬CrO3、叠氮化钠NaN3、甲基璜酸乙酯EMS、硫酸二乙酯。 微核发生率同作用因子的剂量呈正相关，因此可以用简单的微核技术来反映诱变物质对生物的遗传危害。微核技术获得的结果与通过中期畸变染色体计数所获结果相当。微核监测的关键有：材料的选择、样品的处理、微核率的统计。 材料选择染色体数少，个体大，便于统计，对污染物反映比较敏感的材料；这种材料还适应于在当地生长。因污染源性质不同而先后被筛选的植物种类有：百合、紫竹梅、石龙苟、韭菜、大蒜及紫露草等。其中，紫露草微核技术已被应用到各类水质的监测和评价；紫竹梅相对污染物的敏感度和微核反应接近紫露草，但因其分布广、适应性强，更具推广价值， 因而紫竹梅微核技术在我国得到较好的应用和发展。 不同药剂处理的同一植物，当它们达到产生微核的峰值后，由于长时间处理所诱发的微核数之间的差异会变得不显著。同一处理，同一剂量下短时间处理能达到微核的峰值，长时间处理仍只能得到相似的峰值微核值的趋势。因此应通过试验找出最佳处理时间，这样不仅可大大缩短试验周期，而且可使实验结果更加明显、可靠。 微核的识别标准：凡主核大小的三分之一以下的小核；小核着色不论深浅；小核形态可以是圆形，椭圆形，不规则形；小核可以与主核分离，与主核有丝或蒂相连，与主核相依，但各自轮廓清楚的都可作为微核计入，但须注意不要将染色中心当作微核计入。 微核试验已发展至大鼠、小鼠、人、植物等多种类别和材料的检测。近几年又发展了荧光原位杂交、图像分析、流式仪对微核自动化检测等新技术。 2.3 实验材料 （1）实验材料：大蒜、小刀、盖玻片、载玻片、培养皿、电池、超净工作台 （2）实验试剂：1MHCL、70%乙醇、卡诺固定液、改良苯酚 （3）实验仪器：显微镜 2.4 实验步骤 （1）取材 大蒜：于24 ℃水中浸泡24-36 h,选择根长整齐一致，不定根长约0.5－1cm左右的大蒜随机分组。 （2）处理各实验组。应该设定阴性对照、阳性对照、样品组(可设定时间进程或浓度梯度）。 共进行了两大组实验：电池浸出液的浓度梯度和紫外线照射的物理梯度。 ①电池浸出液组设计了：阳性对照、阴性对照、0%~100% 共12组 ②紫外线照射组设计了：0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，4.0h 共5组 （3）恢复培养24小时 。 （4）卡诺固定液中固定24小时，如不立即检测可移至70%乙醇中4℃下保存。 （5）制片??根尖用1MHCl处理的10min,水洗3次。②??切取近根尖分生区的伸长区组织， ?用改良苯酚品红染色10 min。③??压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。 （6）镜检：每个根尖计数1000个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即为该处理的微核千分率。 这是用70%浓度的电池浸出液处理后得到的切片，在细胞核的外围突出了一部分核物质，可能是微核。 我们分别制作了阳性对照、10%、20%、30%、70%、100%，2.0h切片，并在制作每一组切片时都将其伸长区分为了若干区段观察，制作的切片质量较高，可以清晰地看见细胞核，但细胞核的状态较为正常，均没有发现明显的微核。 4.讨论 （1）实验失败的原因 ①切除的根尖部分太短：我们培养的大蒜，在恢复培养后，根尖已经生长得比较长，为了方便储存以及下一步的制片，我们仅切取了根尖的一部分，可能受到诱变物质作用的根尖组织的区段没有被切下来，中毒的区域离根尖分生区较远。不过我们与其他同学交流了一下，发现所切的长度差不多，而他们组的切片能够清晰地看到微核，因此我们怀疑是电池浸出液的毒性不够大。 ②所选电池中确实没有有毒物质，由于和其他的组同学做对照，我们认为可能是所选电池中确实不含有毒物质，或者有毒物质不溶于水。我们当时得到电池浸出液的方法是：用钳子将电池掰开，将里面的黑色粉末状物质倒出。一共收集了6个电池的