具有GPX活力的抗体片段Fv的制备与性质.pdfVIP

维普资讯 Vo1．21 高等 学校 化 学 学报 No．4 2OOO年 4月 CHEMIC~,．IJOURNAl()FCHINESE IJNIVERS1TIES 566～569 具有GPX活力的抗体片段FV的制备和性质 ． ／ 一 时成波 刘傻 罗贵民 阎岗林 ，＆5 (吉林大学分子酶学工翟教育部重点实验室，长春 l30023) 60 ( 7‘ 一／ ／ 摘要 具有答胱甘肽(GSH)结台部位的鼠抗体3H4(IgM)经胃蛋白酶水解，产生分子量为25000的抗体Fv 片段，用荧光滴定法测定了它与GSH的亲和常数K一117×10L／mat．该片段经苯甲基磺酰氟活化+再经 NaHSe作用，其结合部位的丝氨酸被突变为谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的催化基团硒代半胱氨酸．突变后 的Fv片段表现出很高的GPX活性，其活力高达2500U／~mol，称为Fv抗体酶．动力学分析表明， 酶的 最适温度为 55c，最适 pH 为 7．0，催化机制为乒乓机制t米 氏常数分别为：K (GSIf)一4．16×10q ；抗体Fv片段；抗体酶；人工酶 A————页 南 ：0(2o。。)04-o566—04 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，EC1．11．1．9)属于抗氧化酶系，在谷胱甘肽(GSH)存在下，它能催化 氢过氧化物(ROOH)的还原反应 ]．它与超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶协同作用，能有效地清 除体内的活性氧，肪止脂质过氧化嘲．因此，GPX在防治癌症、心血管病和克山病等方面有明显的作 用口 ]．但 由于天然GPX具有分子量大、来源有限和稳定性差等缺点，人们把注意力集中在此酶的人 工模拟上 ]．我们已经成功地制备了含硒抗体酶，其GPX活力与天然酶址于同一数量级水平 ]．然而 这种抗体酶分子量较大，抗原性强，不适用于治疗． 抗体Fv片段由重链可变区(Vw)和轻链可变区(V一，)两条肽链构成，由于去掉了抗体恒定区(Fc)， 免疫原性及分子量大大减小，同时还能保留对原抗原的结合能力，因而，药物动力学性质得到改善， 从而更有利于临床应用． 为了更好地开发利用含硒抗体酶，我们 由具有GSH结合部位的抗体 3H4制备了它的抗体片段 Fv，进而用化学突变法制备了具有GPX活力的Fv酶，并研究了其性质． 1 实验部分 1．1 仪器与药品 谷胱甘肽还原酶、还原型辅酶H(NADPH)、还原型谷胱甘肽(GSH)、苯甲基磺酰氟 (PMSF)、硼 氢化钠(NaBH)和胃蛋 白酶(pepsin)均为Sigma公司产品；硒粉为Aldrich公司产品；Superose12B为 Phamarcia公司产品，Bio—gelP一10及P一30为Bio—Rad公司产品，其它试剂均为国产分析纯． ALCZ44型高效液相色谱仪 (HPLC)为Waters公司产品tProteinPAK 125HPLC蛋白层析柱 (1cm ×30cm)为大连化学物理研究所产品，Hitachi850荧光分光光度计1EYELAFD一1冻干机1 ShimadzuUV一250型紫外可见分光光度计． 1．2 单克隆抗体的制备 从GPX的天然底物GSH 出发，设计了半抗原GSH—S—DNP丁酯，以戊二醛为交联剂，将半抗原 连接到牛血清 白蛋白上．免疫BALB／c小鼠利用杂交瘤技术，筛选得到单克隆细胞株3H4．将细胞株 注射小鼠体内，7～12d后取腹水，采用聚乙二醇沉淀