胚胎干细胞培养中的饲养层制备.pdfVIP

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(4): 594 专题介绍 特约综述 胚胎干细胞培养中的饲养层制备 在本专题的第2期, 我们已向读者介绍了如何制 期已经作了详细的讲解, 但是培养人胚胎干细胞时, 还 备饲养层细胞来培养小鼠胚胎干细胞。实际工作中, 有几点不同: 陆续有来自全国各地的科研工作者来电询问饲养层 (1) 品系要求不同。目前多数人胚胎干细胞系, 的制备和培养等问题, 这些问题主要分为两类: 一, 饲 如来自WiCell 的H1 、H9 等都适应于CF-1 小鼠的 养层细胞的培养出现污染、细胞死亡、增殖停滞 饲养层细胞。国内常用的近交系小鼠不适于用来制 等; 二, 用自行制备的小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层 作培养人胚胎干细胞的饲养层(如图1); 培养胚胎干细胞效果不理想, 特别当培养人胚胎干细 (2)所用的小鼠胚胎发育阶段不同, 按照我们的 胞时, 干细胞状态不好却不知症结在哪里。 经验, 用于培养人胚胎干细胞的饲养层应取自不大于 这一期中, 我们针对这几个比较常见的问题, 提 12.5 天的小鼠胚胎; 几点建议, 希望大家在干细胞研究的道路上走得更加 (3)扩增的时间不能太长, 一般传到第2代就可用 顺利。 丝裂霉素处理; 1 使细胞培养规范化, 标准化 (4)铺饲养层前需用基质胶预处理培养器皿。 出现第一类问题的实验室一般原因是刚开始从 事细胞培养, 各方面条件还未标准化。常规培养强 调三点: (1)严格无菌。无菌培养设备到位后, 要做的就 是日常清洁和消毒, 防止细菌、真菌、支原体等常 见微生物污染; 条件有限的实验室可以在常规培养时 添加抗生素预防污染。 (2)培养设备维护。定期检测并调试培养箱内 的温度、湿度和二氧化碳浓度, 不稳定的设备经过 较长时间运行后实际参数会有较大偏差, 这一点很容 易被忽略。对温度或二氧化碳浓度有特殊要求的细 胞株要分开培养。 (3)培养试剂。劣质的血清不但不能满足细胞 的生长需要, 而且会携入支原体、内毒素等污染, 建 议购买品牌信誉良好的已经灭活好的血清, 若条件有 限也可自行热灭活处理, 但是血清加热灭活后部分蛋 白成分变性, 对细胞生长的支持能力往往有所下降。 2 细胞扩增过程时间长导致细胞老化, 增殖缓慢 小鼠胚胎成纤维细胞传代培养至3~4代后, 增殖 速度就明显减慢。我们建议取一次原代细胞, 连续 扩增至一定代数后用丝裂霉素处理, 计数批量冻存, 需 Fig.1　Different morphologic status of H1 by using two 要时复苏细胞, 使贴壁后即可使用。 different feeder cells A: Feeder cells from CF-1 mice; B: Feeder cells from no CF-1 mice. 3 培养人类胚胎干细胞对饲养层细胞的要求 一般地, 培养人类胚胎干细胞同样要用小鼠胚胎 (中科院上海生命科学研究院生化细胞所干细 成纤维细胞作饲养层, 制备饲养层的方法在专题第2 胞技术平台　　徐　兰 刘敏英)