分子生物学大实验资料.docVIP

名解： PCR：聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。 T载体：是一种高效克隆PCR产物的专用载体。 感受态细胞：处于容易吸收外源DNA状态的细胞。 转化：指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 质粒：一类在细菌细胞内发现的一种自我复制的非染色体小型环状双链DNA分子。 共价闭环DNA（cccDNA）：通过共价键形成的封闭环状DNA分子，常以超螺旋的形式存在。 开环DNA（ocDNA）：如果DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子就叫开环DNA。 限制性核酸内切酶：能在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。 基因组：单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。 菌落PCR：可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增。 连接酶：又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。 回文结构：双链DNA中含有的两个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称为回文结构，每条单链以任一方向阅读时都与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的。 一、CTAB法提取植物基因组DNA各试剂的作用： 1、提取液去除植物组织中的部分多糖、多酚类化合物等杂质，释放DNA。 2、CTAB为去污剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，破坏细胞膜，同时可使核蛋白解聚，从而使得DNA得以游离出来。 3、β-巯基乙醇可以抑制酚类化合物的氧化。 4、可溶性聚乙烯吡咯烷酮去除多酚类化合物等杂质。 5、EDTA是一种螯合剂，能抑制DNase的活性. 6、苯酚可以使蛋白质变性沉淀、抑制DNA酶活性；并有利于水相和有机相的分离 7、酚/氯仿/异戊醇，Tris饱和酚：作为氧化剂，去蛋白。 8、加入Tris饱和酚离心后可分为两相，上层为含核酸的水相，下层为有机相，分界处为变性凝聚的蛋白质。 9、70%乙醇：去除溶于水的盐及杂质。 10、RNase去除RNA污染。 二、提取DNA的实验结果 三、PCR的体系与反应原理 1、体系 1、10*buffer：保证反应体系的弱碱性和最适PH值，使TaqDNA聚合酶 正常发挥作用。 2、DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。 3、2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。 4、DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。 5、脱氧单核苷酸（dNTP），用于构造新的互补链。 6、Mgcl2：促使酶的活性，影响PCR产量和产物的特异性。 7、缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。 2、基本原理及过程 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 其过程可简述为：在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA，四种dNTP，和耐热的Taq聚合酶及两个合成的DNA引物，并有镁离子存在。 变性-退火-延伸三温度点 1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA。 3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 3、PCR电泳图：与marker扩增出来在同一位置，eg500bp；若不同，则为非特异性扩增。 反应中，两条引物上的互补碱基相结合形成的聚合体四、PCR产物的T载体连接 1、为什么要用T-载体？ 答：高效克隆PCR产物的专用载体，可以大大提高PCR产物的连接，克隆的效率。 2、蓝白斑筛选的原理： 答：现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底