鸡（Gallusgallus）IFNy基因重组蛋白复性条件优化及生物活性鉴定研究.pdfVIP

14 2012年第3期 刨新技术 TIANJINSCIENCETECHNOLOGY 刘鼎阔 王立红 张 勇 (鼎正动物药业(天津)有限公司 天津 300402) 鸡(Gallusgallus)IFNy基因重组蛋白 复性条件优化及生物活性鉴定研究 【摘 要】为提高鸡 IFN^y基因重组蛋白的复性效率，用 18种不同的复性缓冲液对在大肠杆菌中表达的 cIFN^y进行复性处理 ，通过 SDS—Page分析 、考马斯亮蓝定量、对鸡胚成纤维细胞 以及对鸡胚的保护实 验检测复性产物的得 率和生物学活性 。研究结果表明 ：去污剂和疏 水剂能保证蛋 白的复性得率和复性效 率 ，重组表达产物得 率可高达 94．7％；氧化还原 电势对是 clFN^y成功复性 的关键 ，有生物 学活性的复性 产物的复性液 中均存在氧化还原对 GSSG／GSH；经去污剂处理后再复性的产物对细胞保护的有效浓度 显著低 于直接复性的蛋 白。 【关冀词】鸡重组干扰素 生物医药 复性条件 生物学活性 IFN 属于 Ⅱ型干扰素 ，又称免疫干扰素 ，是在特定诱生 限公司 )，38℃孵化 ，控制湿度 一60％。 剂 的作用下 由多种细胞产生的具有高度生物活性 的可溶性糖 1．1_3 鸡新城疫病毒 RubulavirusNewcastlediseasevirus(NDV) 蛋 白，是一种重要 的细胞 因子 。mlFN 在抵抗哺乳类和鸟类病 新 城疫 病毒 NDV(CVCC，AV1611)，购 自国家兽 医微生物 菌种 原侵染 中具有重要的作用 ，对肿瘤 、细菌 、犏毒H以及寄生虫5[1 保 藏 中心 ，经 SPF鸡胚 尿囊接 种 ，增 殖一代 ，毒 力 为 10CLD 等具有 多重抵抗作用 。目前研究 已证实鸡 IFN 对流感病毒 、 50／0．10mL。 新城疫病毒 、马立克氏病毒、17-Ol鸡劳氏肉瘤病毒l1ol等具有较好 1．2 方法 的抑制作用 ，它不仅参与机体对病原侵害 的保护性应答 ，还可 1．2．1 cIFN^y复性条件 的探索 通过细胞 的信号通路广泛参与包括调节机体 MHCII成熟 、抗 ① 利用缓 冲液置换 ，以PBS进行透析复性 。将纯化得 到的 原呈递等在内的免疫调节 ，是机体内重要的免疫增强剂。I“1 鸡重组干扰素 的浓度稀释到 100pgJmL，㈣将其全部转移人 鸡 的IFN 基因 由4个外显子和 3个内含子组成 ，其开放 透析袋后 ，放在 4℃预冷的透析液 I一Ⅲ(40mMTris—C1，300mM 性 阅读框有 495个碱基 ，编码 19个氨基酸 的信号肽和 145个 NaC1，Urea浓度分 别为 6．0M、4．5M和 3．5M，pH=8．0)中透 析 氨基酸的成熟蛋 白，其成熟蛋 白大小约为 18kDa。本实验室从 24h，每种透析液持续透析 8h，每 4h更换一次。转移 5mL至 依 莎褐鸡 中克 隆获得 eIFN (Genbankaccessionnumber： 一 新透析袋 ，放入透析液 Ⅳ (PBS)中透析 24h，间隔 4h更 换一 AY705909)，并成功利用大肠杆菌表达 出具有生物活性 的鸡 次透析液 ，期间用磁力搅拌器温和搅拌 。复性完毕 ，取 1mL样 IFN_y。 怛 由于鸡 IFN 在大肠杆菌 中表达效率过高 ，其表达 品，4℃，10000g离心取上清液进行考马斯亮蓝蛋 白质定量和 产物主要以无活性 的包涵体形式存在 ，需对包涵体进行变性 、 SDS—PAGE电泳分析 。 复性等后续 处理工作 ，以获得具有生 物学 效应的重组表达产 ②利用不 同复性液进行透析复性 。参照①的方法 ，透析 降 物 。不 同的重组 蛋白的复性条件有非常大 的差异 ，复性效率显 低纯化所 得的鸡重组干扰素 1 中的变性剂浓 度至 3．5M 后 ， 著不 同，这些严重制约鸡 IFN 的工业化生产 。因此 ，我们对蛋 分别转移至新透析