实时荧光定量PCR技术与应用.pdfVIP

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维普资讯 叩圈杈 2008年第l3期 重囵隧 篓羹 ≥曩 实时荧光定量PCR技术及应用 。北京市平谷 区动物疫病预防控制 中心 葛忠源 熊东艳 张启勇 实时荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上 值的某一时刻,PCR反应仍处于指数增长期 ;Ct 发展起来的核酸定量技术 ,于 1996年 由美 国 值与模板的最初总量存在对数关系。最初DNA的 AppliedBiosystems公司推 出。当前 ,实时荧光定 量 (No)和Ct值之间的线性对数关系可通过公 量PCR技术应用范围很广,例如,能从粪便材料 式logNo=a—b·Ct表示。其中,a和b是常量,可通 中分离出的细菌DNA来精确定量检测肠道菌,使 过标准曲线计算 出来。为了对未知模板进行定 我们能详细地分析肠道中优势菌与荧光原位杂交 量分析,前提要确定ct值和制定荧光定量标准 (FISH)及培养方法检测不到的非优势菌,为理 曲线。 解肠道菌群与机体状况关系提供重要线索。该技 1.1 Ct值的确定 Ct值是在PCR循环过程 中, 术从原理上分为荧光染料检测模式和荧光探针检 荧光信号开始 由本底进入指数增长阶段的拐点所 测模式两方面。 对应的循环次数。在实际操作中,这个时刻即每 1 技术原理 个反应管内的荧光信号达到设定阈值的时刻,由 实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中 此ct值取决于荧光阈值。荧光阈值是以PCR反应 加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实 的前 15个循环荧光信号作为荧光本底信号,一 时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对 般荧光阈值定义为3~l5个循环荧光信号标准偏 未知模板进行定量分析。荧光染料能特异性掺人 差的1O倍。图l为ct值确定曲线。其中,横坐标 DNA双链而发出荧光信号 ,不能掺人DNA双链 为循环数 ,纵坐标为模板DNA的起始拷 贝数 中的荧光染料分子不发出荧光信号,从而保证荧 (dRn) 光信号的增加与PCR产物的增加同步。荧光探针 法是将荧光共振能量传递 (FRET)技术应用于 常规PCR中,在探针的5 端标记一个荧光报告 基团 (R),3 端标记一个荧光淬灭基团 (Q), 两者可构成能量传递结构,即5 端R发出的荧 厂 ’ 光被 3 端 Q吸收或抑制 ,当R与Q距离较远 r ‘ 时,Q的抑制作用消失 ,荧光信号增强,荧光检 测系统可接收到荧光信号。反应信号的监测贯穿 · · ct值 于整个反应过程 ,所得数据用于定量必须遵循以 0 5 l0 l5 20 25 30 35 40 下原则:必须产生一个信号显著高于背景的循环 循环数 数,该循环数称为循环阈值 (ct值);在确定ct

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