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RNA干扰研究进展 1 1 2 谢克亮 王世平 赵长安 (1新乡医学院本科2001级一部，2新乡医学院生物化学教研室 河南 新乡 453003) RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防 御机制，是指内源性或外源性与靶基因的转录产物 mRNA 存在同源互补序列的双链 RNA(double-stranded RNA，dsRNA)在细胞内特异地降解该mRNA，从而致使特异性的基因有效封闭的 过程，是一种序列特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。RNAi 现象已在不同种属的生物体中发现，下面对RNAi的作用机制、作用特点、生物学意义和应用等的最新 研究进展作一综述。 1. RNAi的作用机制与特点 1.1 RNAi发生的分子机制 RNAi的详细机制和过程还不十分清楚，目前大致分为以下几个阶段进行：①siRNA的形成阶段： 此阶段需要Rde-1,Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1,4编码的蛋白识别 外源dsRNA，引导dsRNA与Dicer结合，然后，Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21-25 nt大小的 小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后在向核 外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21-25nt大小并在3′端 带有2-3个碱基悬端且5′端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。Dicer家族在进化上非常保守， 有5个组成部分：N-端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域(Piwi，augonaute，Zwille/pinehead，PAZ)、 2个 RNaseIII结构域和C端dsRNA结合基序。Dicer在体内一般是以二聚体的形式发挥作用的，由于 [1] 不同种族Dicer分子大小不一样，所以dsRNA被切割成的siRNA大小具有种族差异 。② RNA诱导的 沉默复合物（RNA-induced silicencing complex，RISC）形成阶段：生成的siRNA和RNAi特异性酶 如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC，具有序列特异性核酸内切酶、 [2] 核酸外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。③效应阶段 ： siRNA引导RISC 与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶（如qde-3，mut-6，mut-14）的作用下使siRNA链解离，并 使RISC由250kD大小的前体形式变成约100kD左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的 正义链相互交换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5′起始端下游7-10个核苷酸处切断 mRNA，起到特异的抑制基因表达的效果。④扩增阶段：该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA 为摸板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产 生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且 能将异常的单链RNA转变dsRNA。RdRP还是一个重要的“sensor”，它能识别正常和异常的RNA。转 [3] 基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程 。此外，RNAi的扩增效应还可能存 在另外两种机制：①Dicer将长dsRNA切成初级siRNA ，这一放大水平取决于dsRNA的长度；②siRNA 在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。 1.2 RNAi的特点