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PCR快速诊断浅部真菌病的初步探讨 李筱芳 陈辉 崔凡 刘维达 中国南京医学科学院皮肤病研究所 210042 摘要 目的：初步建立和评价应用PCR技术直接从临床标本中检测浅部真菌病病原真菌的方法。 方法：采用蛋白酶K消化法和煮沸法处理临床标本，从中提取致病菌DNA，然后用真菌通用引 物ITSI进行PCR扩增检测，并与直接镜检和培养法作对比。 方法约需8h即可完成从标本处理至结果判读的全过程。 结论：PCR检测具有较好的特异性和准确性，且比培养缩短了近2w的时间，为I临床快速诊断浅 部真菌提供了全新的思路。 关键词：浅部真菌病 聚合酶链反应 诊断 Y 浅部真菌病是皮肤科的常见病和多发病，目前确诊主要依据直接镜检和培养，前者不同实验室 的阳性率差异较大，且不能鉴定菌种：后者敏感性差，耗时。因此，建立一种更优的实验室诊断方 法具有较好的临床应用前景。国内已研究开发了多种感染性病症的基因扩增检验技术，部分已有商 ·诮化试剂盒，并被作为扩大的金标准方法之一。我们将这一方法应用于浅部真菌病临床标本的检测， 希单使该病的诊断、治疗方案的制订更为快速、客观和准确。 材料和方法 准菌株由中国医学真菌保藏管理中-tl,提供。 除浅部真菌病的患者。取材前先用75％的乙醇消毒局部，然后刮取病变活动部位的皮屑或甲屑，头 癣则取病发。所得标本分为三部分，一部分用于镜榆，另一部分接种于含氯霉素和放线菌酮的沙氏 培养基，其余部分置于无菌Ep管中备DNA提取。 3临床标本DNA的提取：采用蛋白酶K消化法和煮沸法消化角蛋白并破壁，酚．氯法抽提DNA。 培养为阳性的菌株及参照菌株也用同一方法提取DNA。 3’；5’-TTCGCTGCGTTCTTCATCGA．3’)，反应总体积为50ul，含5u110 Tag酶。反应条件：94C 物于含EB的2％琼脂糖凝胶上稳压电泳，紫外灯下观察结果。 裴氏着色真菌(D。。)的DNA，以观察反应的特异性。 引物扩增，可以检测到的最高稀释度即为PCR检测的灵敏度。 7．质量控制：严格无菌操作，样品制备区、反应体系配制区和扩增产物检测区独立，并设置阴 性(以三蒸水替换模板DNA)和阳性对照(红色毛癣菌标准菌株T．．)。 8．统计学处理：直接镜检、培养和PCR三种诊断方法有两种或两种以上为阳性，方能视为真阳 性，以此为“金标准”计算各种方法的临床诊断敏感度、i临床诊断特异度、阳性预测值、阴性预测 “金标准”的一致性。 结 果 1 色毛癣菌标准菌株的大小一致。PCR的检出率为41．1％，其中甲部18例，体股部17例，手足部1 阳性。(图1) 圈I真菌ITSI区PCR扩增结果1：ladder；2：人体细胞；3：金黄色葡萄球 菌：4：大肠杆菌；5：阴性对照；6：I例来源于足部镜检为阴性面PCR和培养均为阳制 的标奉；7：临床标本；8：‘j7相对应的临床分离菌株；9、10：一患者于．足皮膨标奉． 1 1：红色毛癣菌标准菌株；12；I例手部湿疹排外真菌感染的标奉。 直接镜检、培养和PCR三种诊断方法有两种或两种以上为阳性(真阳性)有57例，三种诊断方 、临床诊断敏感度、临床诊断特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度见表1-表4。 法的Kappa 表1镜检检测结果分析表 表2培养检测结果分析表 表3 PCR检测结果分析表 表4三种诊断方法评价指标的比较 +P0．05。 1种真菌