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HIF一1
a基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
沈上杭王占祥’陈玉英毛贺辉，谭国伟，刘希尧，薛伟明，陈东汉，陈寿仁，张涛
厦门大学附属第一医院神经外科
缺氧诱导因子一l factor一1a，HIF一1
a(Hypoxia-induciblea)是目前所发现的止常细胞以及肿瘤细胞适
应缺氧的最关键的转录冈子【1】，其基冈的功能研究具有非常重要的意义。很多肿瘤存在HIF-1
Q的高表达，并与
肿瘤的侵袋转移，耐约等相关【2】。已有研究表明HIF一1
l
者间接地参与了血管新生、基质缺氧微环境的发生以及细胞增殖与凋亡的调节过程。Gi
质瘤U251细胞株上shRNA稳定转染取得显著效果。可见。如人为干预HIF-1
a的功能将有望控制肿瘤细胞的增殖。
本研究选择慢病毒lenti Q
lox3．7表达系统，采用基因直接克隆连接的方法，构建表达HIF-1shP,NA的慢病毒载
体。
1材料与方法
1．1材料
i lox3．7、E．coli DH5
293T细胞、慢病毒表达载体plent Q均由厦门大学生命科学学院实验室保存；T4DNA连
i
试剂盒为Tiangen公司产品。慢病毒包装系统由plentlox3．7、PHR、VSVG质粒组成。
1．2方法
1．2．1 a基冈表达的引物，正义链：
shRNA慢病毒载体构建确定用于载体构建的干扰HIF一1
AGl_GAcl℃1GGAlcttttttc一3’：
5’-tGATCCAGAGTCACl粥AACTTtcaagagAAGTTCC
反义链：
5’-t tgaAAGTTcCAGTGACTCTGGATCa一3’：
cgagaaaaaaGATCCAGAGTCACTGGAACrrctct
I和)(hoI舣酶切后的慢
(内含XbaI和XhoI酶切位点)，由Invitrogen公司合成。引物退火形成双链DNA，与Xba
i OH5
i 13．7)连接，转化火肠杆菌E．col
病毒载体pLentfox3．7(pl
I秆IHpaI双酶切电泳鉴定。
剂盒提取质粒，经)(ho
1．2．2慢病毒包装采刚磷酸钙转染法，具体为：转染前一天将293T细胞铺
丁．100咖di
20
ug；PHR15ug；VSVG
洗，加入5ml预热的DMEM。按下列量比配置转染试剂体系：A：plasmid(pLL3．7
通讯作者：F占祥
E·Mall：wangzx@xmbmin．com
281
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