公猪精液DNA提取和检测方法的优化设计.pdfVIP

第三届全国猪人工授精关键技术研讨会论文集 公猪精液DNA提取与检测方法的优化设计 刘向东向安静程文科彭中镇赵书红” (农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，华中农业大学农业，武汉，430070) 摘要：笔者对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取高质量的猪精液基因组DNA 的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。经过对比实验，我们最终确定了最优处理， 分述如下：使用自然分层后精液下层的精子沉淀代替原始精液来提取DNA能够取得更好的效果；在本研究采用的1．5ml 骤按文中通用步骤所述，就可以获得高质量的基因组DNA。同时本研究也确定了低浓度琼脂糖凝胶电泳定性检测DNA 质量的最佳条件：琼脂糖凝胶浓度为0．瞄，电压为80v／20cM，DNA上样量为2ug，电泳至少30rain。 关键词：猪精液DNA提取DNA检测优化 基因组DNA是动物遗传物质的载体，随着分子生物学和分子育种的发展，基因组DNA提取与 保存成为动物科学实验和生产育种过程中越来越重要的内容之一。猪是我国重要的动物性蛋白来源。 在实际育种生产和科学研究过程中，我们通常需要大量高质量的公猪基因组DNA来进行遗传鉴定和 科学实验。通常情况下这些DNA是从动物的血液、肌肉以及肝脏等组织中获取的。对于公猪而言， 公猪的精液是相对于其他组织更容易获得的，所以利用精液来提取公猪DNA是更有效的方法。但国 内目前尚没有最优化的公猪精液基因组DNA提取方案的报道。 提取动物基因组DNA的方法种类繁多，目前主要分成两种，一是试剂盒法，二是经典的酚仿抽 提法。试剂盒法的优点是简便、快捷，但缺点是价格昂贵，有的产品DNA产率较低。酚仿抽提法虽 然操作略微繁琐，但总的来讲价格便宜，而且能够获得高质量的基因组DNA，所以目前应用十分广 泛。在利用酚仿抽提法提取基因组DNA的过程中，每一个环节均可影响实验的结果，其中初始样品 类型、初始样品量、PK剂量与消化时间和酚抽提次数是重要的影响因素。因此，笔者基于经典的酚 仿抽提法对猪精液基因组DNA的提取方法进行了初步研究，旨在建立一种最优化的提取和检测高质 量的猪精液基因组DNA的方法，为做好猪分子育种和分子生物学科学研究提供必要的技术支持。 1材料 1．1试剂 NaAC、 ”通讯作者：赵书红教授，博士生导师，主要从事动物功能基因组学和动物育种的研究工作。 153 10XTE Buffer(pH．8．O)、5×精子提取液10ml，混合均匀，高压灭菌，室温保存。 1．2仪器和耗材 I／ 样；酒精棉球等。 2方法 2．1不同因素对DNA提取效果的影响 为了使比较基础一致，除改变的步骤外，其余的步骤均使用本文2．3通用方法。 2．1．1初始样品类型的不同提取效果 将精液静置，待其自然分层，上层为精清，下层为精子沉淀。分别从精清和精子沉淀中各取200ul 提取DNA，每组3个重复，比较其提取效果。 2．1．2初始样品量对提取效果的影响 2．1．3 PK消化时间对提取效果的影响 比较其提取效果。 2．1．4 Pg剂量对提取效果的影响 效果。 2．1．5酚抽提次数对提取效果的影响 分两组，每组2个重复，酚抽提分别1次和2次来提取DNA，比较其提取效果。 2．2不同因素对电泳检测效果的影响 分析影响DNA的定性检测的不同因素，所用的DNA全部来自同一管高质量基因组DNA。 2．2．1胶浓度对电泳的影响 分3组，每组2个重复，分别用O．8％、1．2％的琼脂糖胶检测。 2．2．2电压对电泳结果的影响 分3组，每组2个重复，分别用80V、120V电压检测。 2．2．3上样量对电泳的影晌 ≈j月全目猪人T授精关键技术研讨会论立集 分3组，每组2个重复，分别上样2ug、4ug、6ug基因纽DNA。 23通用方法 231精液洲^提取”” 吸取100111精于沉淀：加入400ulddFl20、1001115×