海藻糖对酶的保护作用及其的初步的研究.pdfVIP

海藻糖对酶的保护作用及其机理的初步研究 扬小民陈惠晴扬基础 00084) (清华大学化工系北京1 摘要本文研究了海藻糖，蔗糖，葡萄糖和萄聚糖对纤维素酶，过氧化氢酶及腱蛋白酶在高温下 的保护作用，初步讨论了海藻糖的保护机理．研究表明海藻糖能够明显地保护这几种酶，使它们免 爱高温所造成的损伤．并且在比较试验的基础上，对海藻糖的保护作用提出了一个新的解释，即认 为干燥过程中．海漂糖分子在酶空闻结构的空嚏中通过氨键同酶结合，降低了酶的相变温度．避免 了酶由于发生相变所爱的掘伤；f；j时，海藻糖在酶的空隙中转变成玻璃态，形成稳定的框架结构． 使酶固定其中，无法发生构象的变化． 1前言 海藻糖是由*l，4键相连的非还原性=糖，通过对隐定生物的研究，发现许多微生物在极 端条件F，譬如：干燥，高渗j曩压。其体内会孝生高浓度海踩糖的聚集。因此海藻糖被普遍认 为是这类生物在脱水状态下保箍其生物活性的蓉键物质。许多学者研究了海藻糖对生物活性物 质如菌体m2l、脂质体【”q、酶p翻，甚至动物组织¨0～12]等．经历干燥和冻融过程的保护作用。 当前，学术界对海藻糖保护机理没有一致的看法。大体上有两种解释：～种是水替代假说， 即海藻糖的羟基和生物物质的表面基团结合，减小了其由于干燥脱水而引起的相转变温度上升 的趋势，使得生物活性物质避免；『由于发生相变所造成的机械损伤：另一种是玻璃态假说，即 海藻糖干燥后呈玻璃态，这种相掭的分子处于援不活跃状态，这就束缚了其所包裹的生物活性 物质发生构象上的变化，同时又阻碍了细胞之间的融合，从而对生物物质起到保护作用。 本文从这两种假说的机理八手，除海澡糖外，还选择了能够很好同酶分子表面结合但玻璃 态转变温度较低的葡萄糖，具有较高玻璃态转变温度但不能同酶分子表面结台的葡聚糖．以及 分子形态同海藻糖很相象但玻璃态转变温度较低的蔗糖。分别研究了它们对实验室和工业中常 用的几种酶的保护作用。实验结果表明海藻糖确实能够使得这些酶免受高温存放所带来的损伤。 同时通过分析不同的糖的保护能力，从宏观上对两种可能的机理进行了比较和讨论，认为这两 种机理对海藻糖的保护作用都有贡献，而且海藻糖的分子大小也起到至关重要的作用。 2材料和方法 海藻糖，由日本林原商事株式会社提供，食品级，含量大于99％。 葡聚糖，平均分子量19200，sigma公司。 过氧化氢酶(牛肝)，上海丽琢东风生化技术公司。 胰蚩自酶(牛胰)，中科院上i鼙生化所东风生化技术公司。 纤维素酶(绿色木霉)，上海丽珠东风生化技术公司。 将一定浓度的保护剂溶液同]Omg／ml的酶溶液混合，等体积分装于冷冻干燥管中，放在-20 ℃冰箱中冷冻20h。然后在．35C，30Pa下冷冻干燥{Oh左右，将干燥管密封，在一定的温度下 存放一段时间后分析剩余酶活。 3结果与讨论 3．1不同的保护剂对胰蛋白酶的保护作用 如图l所示，在85℃下，放置270h后，没有添加保护剂的酶粉仅有65％的活性保存卜来： 而加入海藻糖：酶的量为l：1和l：2．5的酶粉的剩余活力分别为53％和51％；加入葡聚糖：酶的量 为1：l和的酶粉的剩余活力为82％。可见这两种糖对胰蛋白酶有很好的保护作用。 由图2及图3所示，在55 4C和65C下，放置lOOh后，没有加入保护剂的酶粉的活性损失 小于15％。但是，j3D,K葡萄糖后酶糟的剩余活力明显下降。例如：加入葡萄糖：酶的量为1：1的 酶，在55C下放置50h后，其剩余活力为39％：在65。C F，放置170h后，其剩余活力仅为5％。 这是因为葡萄糖的羟基同蛋白质表面的氮基酸残基发生反应，而使得酶蛋白的一级结构发生改 变。由此可见，葡萄糖同酶表面结台不仅降低了酶的相转变温度，同时也会因同酶的氨基酸在 高温下反应而使其失活。 ^议坩，I犁井v ||一一姗㈣。 S蟮谣熏苗 爨 保存时间【小时