生成素的微电纯化装置快速除盐的研究.pdfVIP

第37卷 分析化学(FENXIH【IAⅪ7E) 增刊 Chinese 2009年10月 Joumal F092 ofAnalyticalChemistry 重组人促红细胞生成素的微电纯化装置快速除盐研究 庞楠楠1 周宇1 白玉1 廖杰2 刘虎威q 1(北京大学化学与分子工程学院，北京100871) 2(中国人民解放军总医院，北京100853) human 重组人促红细胞生成素(recombinant 蛋白激素，可治疗慢性肾衰竭、癌症、HIV感染、外科手术中异型输血引起的贫血。它也被作为 多肽链的糖基化属于后修饰过程，依赖于合成rhEPO的细胞种类以及各种物理化学条件和蛋白的 分离纯化条件。检测尿样中的rhEPO是兴奋剂检测的一个难题，因为尿液的成分很复杂，rhEPO 的完整蛋白以及糖链的微观多相性，确定其结构和准确分子量的有效手段。此外还可利用基质辅 肽段的检出限可达0．109／L，完整蛋白的检测仍然为g／L级【1引，因此需要对样品进行预处理，以 实现rhEPO的直接检测。 蛋白质样品的传统处理方法包括有机溶剂沉淀、透析、凝胶过滤以及反相色谱法等。沉淀可 能导致样品损失以及不可逆沉淀；冷冻干燥相对能保持蛋白质活性、有效缩小溶液体积和提高浓 度、损耗和花费低，但不能去除盐等杂质。超滤是一种温和的、非变性的膜分离技术，适用于蛋 白质等大分子溶液的浓缩、纯化以及缓冲体系交换等，它按照样品量和目标分子量选择适当的离 心超滤管，利用离心力截留大分子溶质。蛋白质纯化的最后一步，常采用反相．液相色谱(RP．HPLC) 得到无盐样品，肽或者蛋白质集中在柱项部，用亲水性缓冲液洗脱盐分，用水／乙腈或者水／异丙醇 等流动相对蛋白进行洗脱，缺点在于样品生物活性和构型无法保持，极性大的样品回收率低，且 样品消耗量较大。周宇等利用连续吸附原理(在垂直电场作用下，固体膜可多层吸附蛋白质)高 度集成搭建了具有多层吸附功能的微电纯化装置(Microelectric device，MEPD)。和 purification 常规吸附不同，蛋白质连续吸附不再受固定相键和功能团数目的限制，外加电场可克服多层吸附 时引起的蛋白质．蛋白质静电斥力，使多层吸附更加稳定。 使用流动注射，样品由HPLC自动进样器通过MEPD，盐透过膜被缓冲液带走，蛋白直接进入ESI min在线脱盐。在谱图中，rhEPO特征离子明显，化学噪声小，因此可以避免假阳性检出，低的 化学噪声也大大提高了检测灵敏度。比起多肽链，完整蛋白携带更丰富的信息，包括翻译后修饰 的磷酸化，糖基化等。而rhEPO和内源性EPO的差别恰恰在于糖基化程度不同。 和其他两种比较成熟的脱盐方式的比较结果说明，未经处理样品直接进样，噪声大，无法检 出。当使用C18柱梯度洗脱方式除盐时，100％水相带走盐100％有机相洗脱蛋白，有一定效果， 但仅能检测到一些响应较强的rhEPO特征离子，如m／z Microcon10超滤管利用离 901。Millipore 心力筛分可在一定程度上脱盐，但只能检测到一些rhEPO的特征离子。使用MEPD，化学噪声更 低，能够检测到更多的rhEPO特征离子，离子m／z901的信噪比为12．8，而C18脱盐后该离子信 Microcon 10超滤管脱盐后信噪比为2．0，因此MEPD脱盐效果更好。 噪比3．8，Millil}Iore 本文系国家自然科学基金(No资助项目 10 ‘E-mail：hwliu@plm．edu．en；Td：+86 万方数据 重组人促红细胞生成素的微电纯化装置快速除盐研