猪肺炎支原体显色原位杂交的研究方法建立.pdfVIP

中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集 猪肺炎支原体显色原位杂交研究方法的建立 王占伟，熊祺琰，冯志新，刘茂军，白方方，邵国青。 (江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室／ 国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014) 显色原位杂交检测。结果显示，设计的地高辛标记探针针对Mhp具有特异性，而与其他的猪病原茵无交叉反应； 检测结果可以通过显微镜观测到Mhp定位在支气管／细支气管黏膜表面。此外，人工感染组、自然感染组和健 显色原位杂交法是一种集直观和敏感为一体的检测方法，可以用于Mhp的定位检测和致病机理研究。 关键词：猪肺炎支原体；显色原位杂交；斑点杂交；检测；定位 究和发病模型建立提供必要的技术手段和参考依 猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae， of 据。 Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplasmapneumoniae swine，MPs)的主要病原体，患病猪主要表现为咳 嗽、气喘、生长迟缓和饲料转化率降低【l】。 1材料和方法 insitu 显色原位杂交法(Chromogenichybridization， CISH)是近年来建立的一种新的显色反应与原位杂交1．1 168株、MhpJs株、猪传染性 菌株Mhp 相结合定位检测技术，可以在光学显微镜下原位检测目 的基因扩增结果[2】。在核酸分子杂交研究中应用比较 广泛的非放射性标记物主要有生物素[31、地高辛[4】和荧种均由江苏省农业科学院兽医研究所分离保存。 光染料【51。其中，用地高辛作标记物的探针．其敏 1．2实验动物5头1日龄初生仔猪和10头1月 感性与放射性核素标记的探针相似，是一种理想的 龄断奶仔猪，购买于江苏省农业科学院六合动物科 非放射性探针标记物。 学基地种猪场，经检测均为Mhp抗体阴性。 目前，CISH在个别动物疫病病原【61和人的癌症 1．3主要试剂及仪器显色原位杂交试验和斑点杂 检测中应用较普遍，尤其是乳腺癌的检测诊断【7】。 交试验用试剂均为武汉博士德产品；柱式动物DNA Kwon等利用CISH证实Mhp是吸附在猪肺支气管 提取试剂盒为北京田恩泽生物科技有限公司产品； 和细支气管黏膜上皮细胞上[8]，这为Mhp的致病机 均为leica公司产品。 理研究提供了思路。DeBey等将Mhp接种到新生仔 猪气管培养物中，并检测到Mhp附着于或者至少 1．4地高辛标记探针和Mhp特异性引物的设计与 是紧密结合于纤毛上皮细胞表面，并可能引起纤毛 合成 Fr36基因 根据GenBank登录的Mhp 停滞或者纤毛损伤【9]。本研究利用CISH的原理建立 了Mhp的CISH检测法，为Mhp强毒株致病机理研 基金项目：国家自然科学基金；江苏省农业科技自主创新资金项目(ex(09)619) 作者简介：王占伟(1981．)，男，河北张北人，助理研究员，硕士，主要从事畜禽疫病检测与生物制品开发研究 +通信作者：E．mail163．tom 一109— 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会论文集