红毛新碱给药前后HEK293+α1A受体高表达细胞蛋白质组的二维液相色谱分离和比较.pdfVIP

红毛新碱给药前后HEK293 0c1A受体高表达细胞蛋白质组的 二维液相色谱分离和比较 袁玺龙任静侯晓芳王嗣岑 (西安交通大学医学院，陕西西安710061) 摘要：目的以HEl(293 alA受体高表达细胞为研究对象，研究红毛新碱对其细胞蛋白表 达影响，建立一种二维液相色谱分离和分析方法，并比较给药前后细胞蛋白表达谱的差 异。方法以高效液相色谱(HPLC)为技术平台，对细胞裂解物先后进行一维色谱聚焦 分离和二维反相色谱分离。利用ProteoV．ue软件将二维色谱数据转换成模拟胶图，再利 用DeltaVUe软件对给药前后细胞蛋白表达谱进行比较和分析，找出差异蛋白。结果根 据蛋白的等电点和疏水性建立了精确的细胞蛋白表达图谱，每O．3个pH为一个收集区 段，在pH8．8～3．8的范围内可见蛋白条带约1000条。结论该方法良好的重现性、自动 化以及结果分析的简易化使之在细胞表达谱差异显示中的应用潜力巨大，并且为研究药 物与肿瘤细胞相互作用提供了新的方法和思路。 关键词：蛋白质组，二维液相色谱分离，HEI(293a1A，受体高表达细胞，红毛新碱 蛋白质组学(prote锄ics)是1995年产生的一门新兴学科，它以细胞内全部蛋白质为研 究对象，定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为(如：疾病过程和药物效应) 以及基因表达调控的机制的学科。【l】研究药物与细胞内靶蛋白的相互作用多采用二维凝胶电 泳(2．DE)，可利用蛋白质的等电点和分子量将各种蛋白质区分开来，并将细胞全蛋白质组 进行绘图和药物作用前后比较，但具有相对繁琐、不稳定、灵敏度较低的缺点【2J。目前二维 液相色谱(2D．LC)等新型分离技术有补充和取代2．DE之势。 红毛七(Leonticerobust哪)是小檗科牡丹草属植物类叶牡丹的根茎及根。红毛新碱 (HM06_4)是西安交通大学医学院天然药物与工程中心在红毛七中分离得到的一类新的生 物碱类化合物，具有抗心肌缺血的作用【孓4】。本论文体外培养了HEK293a1A受体高表达细胞， 通过红毛新碱在细胞生长过程中的干预，研究红毛新碱对细胞蛋白表达的影响，再通过二维 液相色谱进行蛋白质的分离和比较分析，进而得出结论，为红毛新碱抗心肌缺血的药理作用 机制研究积累资料。 l仪器与试剂 二维液相色谱仪ProtemeLabTMPF2D和及其配套试剂盒ProtemeLabTMPF2D试剂盒均 为美国贝克曼(Beckm锄)公司产品，试剂盒包括HPCF1D色谱柱(2．1舢×250n瑚)、HPRP 2D无孔硅胶C18反相色谱柱(4．6mm×33咖)、起始缓冲液(startbu位rSB)、洗脱缓冲 液(eluem G-25，Amersh锄Ph砌acia bu丘札EB)，和PDl0G-25脱盐柱(SephadexTM 确s．(ca而oxyeⅡ1y1)phosphille inllibitor 司，乙腈、甲醇、水等购自Fisher公司，均为色谱纯。BCA法蛋白浓度检测试剂盒购于北 京普利来公司。 2实验方法 2．1细胞培养及加入红毛新碱处理 HEK293 Q1A受体高表达细胞(西安交通大学医学院天然药物研究与工程中心)培养于 内。 细胞生长至对数生长期，胰酶消化，加入培养基吹打成单细胞悬液，使用血球计数板进 行细胞计数，重复三次，平均值为细胞浓度。调整细胞浓度至105／ml，每瓶lml细胞悬液接 种至250ml培养瓶中，分两次共平行接种20瓶。每瓶补充新鲜培养基9ml，至终体积为10ml／ 瓶，培养24h。此时镜下可见细胞融合度达50％，其中10瓶为给药组按终浓度30嵋／ml红 毛新碱进行给药，其余10瓶为对照组，加入等量培养基，培养24h。 2．2样品制备 7细 细胞经上述处理后，给药组与对照组分别进行如下操作：使用胰酶消化，收集约10 miIl，在细胞沉淀中加入0．4ml的50IIlIno儿的 胞，用预冷的PBS洗2次，3