人A-%2cγ-珠蛋白基因增强子功能在转基因鼠系统的验证.pdfVIP

人AY珠蛋白基因增强子功能在 转基因鼠系统的验证 刘庆辉1 James JtirgBungert2 DovglasEngel2 1中国医学科学院基础医学研究所生化重点室 2 BM．Northwestern University，USA． Dept．Bioehem．M01．Bid．cell 摘要人p珠蛋白基因簇位于第11号染色体上，含有5个编码基因和多个调控序列。～．珠蛋白基因3’增强子 为一750bp片段；在转染细胞中，该片段可提高报告基因的表达水平；在转基因动物实验中，该增强子的存在可避免 内括基因受到外界“位置效应”的影响。但另有报导显示该片段为一抑制性序列或中性序列。上述不同实验系统 所产生的差异显现出利用短小基因片段的局限性。本文以150kb整个B-珠蛋白基因簇为实验体系，用同源重组方 法去除上述750bp片段，发现整个基因簇中各基因的表达与正常无显著区别，提示该增强子功能可能被其他结构补 偿；或者该片段为一中性序列。提醒人们对小片段基因体外功能实验结果需谨慎诠释。 关键词珠蛋白基因YAC增强子 1引言 Control 约6～20l【b为该基因簇的调控结构，即LCR Locus 作用使各基因依次激活表达、抑制关闭、经历所谓“珠蛋白基因开关”过程…。基因近侧的调控序列包括启动 子、增强子及抑制序列【2 动子驱动之报告基因 CAT 的表达水平达6．23倍【3J。该片段在红细胞中显示含2个DNaseI高敏位点；能 与细胞基质相关蛋白结合，提示可能参与调节染色质高级结构L4J。在转基因动物实验中，该增强子的存在可 使内括基因免受“位置效应”的影响，使个体动物间转基因的表达水平更趋一致t5,6J。但另有实验结果显示 该结构具有抑制相连基因表达的活性L7．80；或对相连之y。基因表达不显示任何影响_9J。显而易见，这种从不 同系统时同一基因片段功能分析的相驳性，提示有必要对该结构的功能在一更完善的系统中进行验证。本 文利用同源重组技术对克隆在人工酵母染色体中的人口．珠蛋白基因簇进行修饰，只删除～．基因3’增强子结 构，而基因簇中的其他结构维持原状，从而得以准确检测该突变对整簇基因表达的影响，确定该结构的功能 特征。 2实验结果 2．1靶向重组体的构建 5’ 端序列与1．6kb 有增强子两侧的同源序列，而不含有增强子结构本身。 2．2从肛珠蛋白基因簇中删除该增强子序列 删除结果，一是删除靶向重组体中的同源序列，产生 回复 野生型基因簇，一是删除原有的同源序列以及增 强子结构产生所希望的突变型基因簇，同理，利用Southern杂交法可区分这两种不同的结构。 】37 8 基因表达鬯誊育唑氅特异竺亦兰譬 笋案 LcB ￡ByAyp．10—kb。 星篓篙冒』墅型劣蓍毁伸6表达为主，成·地3盟瑚卫卫Lu哆—皿一』—二旬 3讨论二生。乒飞f—咤。． A，．基因3‘端750bp基因片段在一系列n 转染细胞和转基因动物实验中显示具有提 WF 埘3_E斯3‘EwT ay3‘E～3_EWT 高报告基因表达或隔绝“位置效应”的特征。 其序列特征亦与鸡B．珠蛋白基因下游之增强 ●150kbp 子结构有类似之处；但另一组实验则显示该 结构具有抑制报告基因表达之活性或只表 Probe Ay3’E Probe 现为一中性序列。上述结果来自不同的实 AyDS 验系统，多与将小片段DNA克隆到含报告基 固1 of andmutant YACs SLmctuae pglobin 因的质粒载体中，不能反映基因簇完整情况 wild-type 下，该结构所行使之调节功能。我们利用人 A． Lc8 e叫RY8B 一7。kbp Sill Sill “” 、 一百 ： 百 。函 4 6 wT1 2 3 4 5 6 wT 2 3 4 5 6 5 ■黼粼 HS3 ￡ 6 RK29 图2转基因鼠的YAC转基因结构 性地删除Ar基因3’端增强子序列，在转基因鼠中检测被删除结构对整簇基因表达的影响，验证其真正的体 内生理功能。结果显示突变型基因簇中各基因的表达水平及发育阶段特异性均与正常基因簇相近，提示该 增强子结构的功能被基因簇内其他结构补偿；另一种可能性是该结构仅为一中性片段。综合该实验结果及 功能分析有其局限性，对所得结果需谨慎诠释。 138