人TNFα分泌型、跨膜型与跨膜稳定型重组体的构建表达及其杀瘤效应.pdfVIP

人TNFa分泌型、跨膜型和跨膜稳定型 重组体的构建表达及杀瘤效应+ 黄家强1 1、 夏2李卓娅2龚非力2 1北京医科大学免疫系分子免疫室2同济医科大学免疫学教研室 摘要TNF-a的分泌型与跨膜型在生物学效应等方面各具特征。为研究比较二型TNF的生物学活性及其作用机 制，本文用IL-2信号肽编码序列置换TNF的前导肽编码序列，构建出一种在真核细胞仅产生分泌型的TNF重组体； 通过缺失二型TAT转换的酶解部位而构建出可稳定表达于胞膜而不被酶解的跨膜型TNF重组体。建立分别只表 达分泌型或跨膜型及可同时表达两型TNF的真核细胞株，并以此作为体外实验模型，比较二型TNF的杀瘤效应。 关键词跨膜型TNF分泌型TNF基因突变表达杀瘤效应基因直接注射 同 与典型分泌型蛋白的合成分泌机制不同bJ：TNF．aN端含有76个氨基酸组成的超常前导肽在内质网不 membrane TNF，M．TNF ，进而通过TNF．d转换酶 TNF-a．converting 组成的17kDa分泌型WNF secmctory J。 受体结合、生物学效应及其作用机制等方面各具特征_l’3 为进一步研究比较两型TNF的生物学效应及其作用机制的异同，本文借助分子克隆及基因突变技术， 可同时表达两型TNF M．TNF 的真核细胞株，并以此作为体外实验模型，初步比较它们的杀瘤效应。 1材料和方法 1．1材料 鼠，购自江西省动物中心，雌雄各半。 细胞培养基、小牛血清 GIBCO ，质粒提取纯化试剂盒、DOTAP转染试剂 Boehringer 偶氮唑盐 Mar Fluka ，hTNF SABC 。 1．2方法 1．2．I M—TNFcDNA mTNF 及其突变体的设计”o 按公布的人TNF—a序列【6]设计PCR引物 略 。 *本课题为国家自然科学基金资助项目 批准号座机电话号码 。 60 1．2．2TNF重组表达质粒的构建及鉴定”“ h后的人外周血单核细胞总RNA，经逆 1 rr删F的克隆及测序：常规方法提取LPS 100．g／mE 刺激4 min、64℃1min、72℃1rain， 转录合成cDNA第一条链。应用引物P1和P2扩增mTNF，PCR反应条件为：94℃1 止法对插入片段进行自动测序分析 373A型DNA荧光测序仪，ABI公司 。 by ex- 2 sTNFm真核表达质粒的构建及测序：采用基因重叠延伸拼接PCR法 genesplicingoverlapping tension 30 cDNA第一条链为模板，用P3和P4扩增基因片段A，PCR反应条件为94℃30s、60℃50s、72。C s，28个循环 10 1 min、62℃1min、72％1商n，共28个循环，72。C min、50℃2nfin、 A、B各1腭混合作为模板，以上述一对外侧引物P3、P2进行PCR扩增，反应条件为：94℃1 72℃3 sTNFm并测序。 by extension overlapping 30 30 条件为：94％4miBy94％1min、60。Cs 片段c 或1lYlin 片段D 、72。C 次后．72℃10 rain。其余同上，重组体命名为pBK—mTNFm。 1．2．3三种TNF真核表达细胞株的建立_7“ CMV转入NIH3T3细胞，继续培养48 并用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆。 测膜结合型TNF M—TNF 对靶细胞L-929的胞毒活性。 表达产物的Western．Blot分析E7]转染细胞传代培养24 器离心透析浓缩 ，进行Western—Blot分析。 1．2．4二型TNF杀瘤效应进行比较研究 1 2．5 rnlNF和mTNFm重组体体内表达实验【loI d分别采集外 小鼠外周血血清中重组TNF hTNF 水平。 2结果 2．1重组体的构建及鉴定 测序分析证明成功建立了表达3种TNF的真核表达质粒 图略 。 2．2表达与鉴定 各一株，分别命名为H．mTNF、H—sTNFm、H—mTNFm 图略 ，并进行Western 的细胞裂解液及培养上清仅可检出17 两型TNF，且其固定细胞及培养上清均具胞毒效应。此外，以上3株细胞的固定细胞及培养上清的胞毒效应 均可被抗hTNF单抗所阻断。 61