大鼠心肌素慢病毒RNA干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞分化的影响.pdfVIP

中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2011，27(4)：823—828 · 823 · [文章编号] 1000—4718(2011)04—0823—06 · 实验技术 · 大鼠心肌素慢病毒 RNA干扰载体的构建及其对 血管平滑肌细胞分化的影响 揭 伟 一， 申志华 ， 王晓燕 ， 况 东 ， 王国平 ， 敖启林 (’广东医学院基础学院病理教研室，广东 湛江524023； 华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所，湖北 武汉430030) [摘 要] 目的：构建大鼠心肌素(myocardin)慢病毒RNA干扰 (RNAi)重组质粒 ，分析该RNAi质粒的干扰 效果及其对血管平滑肌细胞(VSMCs)分化的影响。方法 ：设计并合成3对针对大鼠myocardin的shRNA片段，退 火后将双链 oligo—DNA克隆入慢病毒质粒载体pGCS1L—GFP获得重组干扰质粒 pGCS1L—GFP—shMyocd。以 pEGFP—N1／X124G表达载体构建含Flag标签的myocardin表达质粒pEGFP—N1一Myocd。将重组干扰质粒和 过表达质粒共转染293T细胞，Westernblotting分析 Flag标签蛋白的表达 ，筛选出干扰效率最好的干扰质粒并大量 扩增。干扰质粒转染大鼠主动脉VSMCs，RT—PCR和Westernblotting检测 myocardin及分化标志物SM22a的表 达。结果：成功构建大鼠myocardin的慢病毒干扰质粒 pGCSIL—GFP—shMyoed和过表达质粒pEGFP—N1一 Myocd。上述2种质粒共转染293T细胞后 ，1号干扰质粒转染组 Flag标签蛋白表达下降最显著。将 1号质粒进行 大包装 ，获得滴度为 1×10 TU／L的慢病毒颗粒，该病毒转染 VSMCs后，myocardin表达明显下调并伴随分化标志 物SM22ot表达的显著下降。结论：成功构建大鼠myocardin慢病毒重组干扰质粒pGCSIL—GFP—shMyocd；抑制 基因myocardin表达后伴随VSMCs分化的表达下降，提示 myocardin在 VSMCs分化过程中的重要性。pGCSIL— GFP—shMyocd重组质粒的成功构建为后续研究特定病理条件下(如动脉粥样硬化)VSMCs表型转变的分子机制 奠定了基础。 [关键词] 心肌素 ；载体构建；慢病毒 ；血管平滑肌细胞 ；细胞分化 【中图分类号] R329．2 【文献标识码] A doi：10．3969／j．issn．1Ooo一4718．2011．o4．400 ConstructionofalentiviralRNA interferenceved[ortargetingratmyo- cardinanditse仃ectonvascularsmoothmusclecelldi rentiation JIEWei一，SHENZhi—hua ，WANGXiao—yan ，KUANGDong ，WANGGuo—ping ， AO0i—lin (DepartmentofPathology，SchoolofBasicMedicalScience，GuangdongMedicalCollege，Zhanjiang524023，China； InstituteofPathology，TongfiHospital，HuazhongUnive~ityofScienceTechnology，Wuhan430030，hCina．E—mail： Aoqilin@126．corn) [ABSTRACT] AIM：ToconstructalentiviralRNAinterference(RNAi)vectortargetingratmyocardinmRNAand toinvestigateitseffec