靶向MAG基因shRNA慢病毒载体的构建及其对MAG基因表达的沉默.pdfVIP

中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysiology 2013，29(9)：1725．1728 · l725 · [文章编号] 1000-4718(2013)09．1725-04 · 实验技术 · 靶 向MAG基 因shRNA慢病毒载体 的 构建及其对 MAG基因表达的沉默=l= 陈 舒 ， 罗 铭 ， 蔡望青 ，李方成 ，何志威 ， 刘安民 (中山大学孙逸仙纪念医院 神经外科，肿瘤科 ，广东 广州 510120；香港中文大学，中国香港) [摘 要] 目的：设计以MAG基因为靶点的短发夹状 RNA(shRNA)，构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干 扰体系对MAG基因表达的影响。方法 ：将3条靶向大鼠MAG基因的shRNA片段插入至慢病毒载体 pWPI，与 pCDNA3一MAG-FLAG质粒用Lipofectamine2000共转染293T细胞 ，Westernblotting法鉴定出最有效的shRNA。此重 组质粒与pAX2和pMD2G经293T细胞包装后 ，产生的重组慢病毒感染少突胶质细胞，48h后 Westernblotting法检 测MAG蛋白的表达情况。结果：经双酶切后测序鉴定，构建了MAGshRNA慢病毒载体 pWPI—MAG，鉴定出shR— NA-2为最为有效的shRNA。重组慢病毒能明显抑制少突胶质细胞中MAG的表达。结论：慢病毒介导的shRNA 干扰技术可特异性阻断MAG的表达 ，为进一步探讨 MAG特异性 shRNA治疗神经系统髓鞘损伤奠定了基础。 [关键词] 短发夹状 RNA；髓鞘相关糖蛋白；慢病毒 [中图分类号] R737．25 [文献标志码] A d0i：10．3969／j．issn．1000—4718．2013．09．034 ConstructionofshorthairpinRNA lentiviralvectortargetingMAG gene anditssilencingeffecton 14G gene CHEN Shu ，LUO Ming ，CAIWang—qing ，LIFang-cheng ，HE Zhi．wei，LIU An．min (D‘epartmentofNeurosurgery，DepartmentofOncology，SunYat—senMemorialHospital，SunYats·enUniversity，Guang- zhou510120，China；TheChineseUniversityofHongkong，Hongkong，China．E-mail：doclinam@yahoo．com．ca) [ABSTRACT] AIM ：Toconstructlentiviralvector-basedshorthairpinRNA (shRNA)targetingmyelin—associated glycoprotein(MAG)geneandtoevaluateitsinhibitoryeffectontheexpressionofMAGgene．METHODS：ThreeshRNA fragmentstargetingMAGgene(shRNA1，shRNA2andshRNA3)weredesignedandclonedintolentiviralvectorpWPI． Thethreerecombinantplasmidswereidentifiedbyenzymedigestionandsequencing．PositiveplasmidswereCO-trnasfected withpCDNA3-MAG-FAL G into293T cells，andthemosteffectiveshRNA forknockdownofMAG genewasscreenedby Western blotting．Cellstransfectedwithe