靶向TNF-αRNA干扰重组体的构建及序列分析.pdfVIP

· 1870· ChineseJournalofPathophysiolo~ 2009。25(9)：I870—1872 [文章编号】 1000-4718(2009)09—1870-03 靶 向TNF一0【RNA干扰重组体的构建及序列分析水 宋晓宇 ， 李铁钢 ， 于艳秋 ， 张海鹏 (。中国医科大学基础医学院病理生理教研室，中国医科大学附属盛京医院急诊科，辽宁 沈阳110001) [摘 要] 目的：利用RNA干扰技术，筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子一 (TNF— )表达的小发 夹状 RNA(shRNA)片段，设计并构建质粒重组体 ，进行序列分析，为探索TNF—XI相关疾病的基因治疗提供新途 径。方法：原代培养小鼠腹腔巨噬细胞 ，15％DMEM培养液调细胞浓度为2×10cells／L接种于6孔板，3mL／weU； 细胞用脂多糖 (LPS)激活，ELISA法测不同时间培养上清中TNF—d的浓度；将针对TNF— 基因的5段 shRNA干 扰片段的表达框经 PCR扩增、纯化后，与转染试剂混合转染入巨噬细胞，细胞用 LPS激活24h后 ELISA法测培养 上清中TNF— 的浓度、RT—PCR法测细胞TNF— mRNA的表达；将最有效抑制TNF一 表达的干扰片段克隆入 质粒载体 ，转化DI-ISXI感受态菌株 ，提取质粒 ，进行测序分析。结果：LPS刺激巨噬细胞24h后，细胞分泌TNF— 达高峰；转染了干扰序列 1的细胞培养上清中TNF一仅浓度较对照组下降最明显(P0．05)，达59．46％，TNF一0【 mRNA的表达较对照组被抑制了61．20％；将干扰序列1DNA序列克隆到载体上，经测序鉴定确实为所需序列。结 论：成功筛选出靶向，rNF— 基因的shRNA于扰片段并构建质粒，可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF— mRNA的表达，为TNF—XI相关疾病的基因治疗提供新途径。 [关键词] 肿瘤坏死因子；RNA干扰 [KEYWORDS] Tumornecrosisfactor；RNAinterference [中图分类号】 Q786 [文献标识码】 A 近年研究发现，复杂的细胞因子网络失衡可视为许多疾 纯化试剂盒购于杭州维特洁生化技术公司。PCR引物合成 病的病理生理学基础。肿瘤坏死因子XI(tumornecrosisfactor 由上海生工公司完成；质粒测序由上海吉凯基因化学技术有 — ， TNF—XI)即是其中一种非常活跃的细胞因子 ，在不同 限公司完成。 水平上阻断TNF一仅表达，有可能对与TNF—q有关的疾病 1．2 动物 C57BL／6雄性小鼠，体重约20g，购 自中国科学 产生治疗作用。RNA干扰 (RNAinterference，RNAi)是指小 院实验动物所。 片段双链RNA通过刺激 目标基因mRNA的降解而特异性抑 2 方法 制 目标蛋白质表达的现象，主要发生在基因转录后，即mRNA 2．1 腹腔巨噬细胞的体外原代培养 小鼠腹腔注射l0g／L 的修饰或翻译水平，近来该技术广泛应用于抑制 目标蛋白表达 淀粉溶液2mL／mouse，24h后腹腔注入 10mL含 10％胎牛血 方面，本研究利用RNA干扰技术，筛选出可以高效、特异性抑 清DMEM培养液，轻按腹膜壁后吸出液体 ，4℃ 1000r／rain 制肿瘤坏死因子 一仅(TNF一 )表达的小发夹状 RNA(small 离心10min，弃上清，用无菌PBS洗涤3次，加入含l0％胎牛 hairpinRNA，shRNA)片段，设计并构建质粒重组体，进行序列 血清DMEM培养液，调整细胞浓度为 2×10cells／L，加入6 分析，为探索TNF—a相关疾病的基因治疗提供新途径。 孑L板 ，每孔3mL。置于37oC、5％CO：培养箱中培养。 2．2 观察活化后 巨噬细胞产生TNF—d的能力 向培养的 材 料 和 方 法 每孔细胞中加入 1g／LLPS10,／LL，分别于刺激后6h、12h、24 1 材料