共培养环境中兔角膜内皮细胞诱导人iPSCs分化.pdfVIP

· l488· 中国病理生理杂志 ChineseJournalofPathophysi0logy 2012，28(8)：1488—1493 [文章编号] 1000—4718(2012)08—1488—06 扯 ， 、 培养环境 中兔角膜 内皮细胞诱导人 iPSCs分化 谭美华 ， 陈建苏 ， 招志毅 ， 丁 勇 ， 钟敬祥 ， 戴 应 ， 李善义 ， 杨皓庄 (暨南大学 第一临床医学院眼科 ，医学院眼科研究所，再生医学教育部重点实验室， 医学院病理生理学系，广东 广州 510632) [摘 要] 目的：观察人诱导多能干细胞 (inducedpluripotentstemcells，iPSCs)与兔角膜内皮细胞 (corneal endothelialcells，CECs)共培养前后的形态学变化 ，检测 iPSCs向CECs分化前后部分标志蛋白表达的变化，为研究 iPSCs向CECs的分化提供实验依据。方法：分离培养兔 CECs并传代，同时使用无饲养层细胞法培养扩增人脐带 源 iPSCs，Westernblotting对其进行鉴定；用量子点对 iPSCs进行标记示踪，以不同密度比例建立 iPSCs与CECs的共 培养模式，用原子力显微镜 (atomicforcemicroscopy，AFM)结合倒置显微镜观察共培养前后 iPSCs的形态学变化 ，免 疫荧光法检测 iPSCs分化前后CD34、CD133、CD31和水通道蛋 白1(AQP1)蛋 白表达的变化。结果：培养扩增的兔 CECs形态为六边肜 ，呈典型的铺路石样外观；iPSCs呈克隆样生长，Westernblotting检测Oct4、Nanog和Sox2多能性 标志蛋白均呈阳性；10nmol／L量子点标记的iPSCs以1／4悬液与融合60％的兔 CECs共培养为最佳模式；AFM结 合倒置显微镜观察到共培养后 iPSCs体积增大，胞浆增多，核浆比减小 ，细胞膜表面可见颗粒状突起物，膜表面粗糙 度增加 ；免疫荧光法检测分化前 iPSCs的CD34、CD133、CD31和AQP1表达均呈阴性，共培养2周后 iPSCs的CD34、 CD133和CD31表达阴性，AQP1表达阳性。结论：与兔 CECs混合共培养后人 iPSCs不仅从形态学上向内皮样细 胞方向转化 ，同时表达角膜内皮细胞标志蛋白AQP1。 [关键词] 诱导多能干细胞；角膜内皮细胞；混合培养 ；显微镜检查，原子力；水通道蛋白1 [中图分类号] R772．2 [文献标志码] A doi：10．3969／j．issn．1000—4718．2012．08．027 M ixed cultureofhuman iPSCswith rabbitcornealendothelialcellsin— ducesdifferentiationofiPSCs TANMei—hua，CHEN Jian—SH ，ZHAO Zhi—y一l，DING Yong ，ZHONG Jing— xiang ，DAIYing ，LIShan—y一l，YANG Hao—zhuang (DepartmentofOphthalmology，fk ClinicalMedicalCollege，InstituteofOphthalmology，SchoolofMedicine，Key LaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation，DepartmentofPathophysiology，SchoolofMedicine，Jinan University，Guangzhou510632，China．E—mail：chenjiansu2000@163．com) [ABSTRACT] AIM：Toinvestigatethemorphologyandproteinexpressionofhumaninducedpluripotentstemceils (iPSCs)inthemixed—cultureenvironmentwithrabbitcoillealendothelialcells(CECs