胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血损伤后H2O2含量和CAT活性的影响.docVIP

胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血损伤后H2O2含量和CAT活性的影响 　　[摘要] 目的 通过正交试验优化胡黄连苷Ⅱ治疗大鼠脑缺血损伤的最佳剂量和时间窗。 方法 应用双侧颈总动脉结扎法（BCCAO）建立大鼠前脑缺血模型，按照正交试验设计分组，经腹腔注射胡黄连苷Ⅱ干预治疗，应用光化学法测定血清和脑组织中过氧化氢（H2O2）的含量和过氧化氢酶（CAT）的活性。 结果 胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的最佳效果，根据血清和脑组织中H2O2含量分析，分别为脑缺血1.5 h/（10 mg?kg）和脑缺血1.5 h/（20 mg?kg）体重。根据血清和脑组织中CAT活性分析，分别为脑缺血1.5 h/（20 mg?kg）和脑缺血1.5 h/（10 mg?kg）体重。 结论 从用药剂量最小化和治疗时间窗最大化的角度综合评价，胡黄连苷Ⅱ治疗脑缺血损伤的治疗时间窗和剂量最佳组合为脑缺血1.5 h腹腔注射10～20 mg/kg体重。 　　[关键词] 胡黄连苷Ⅱ；脑缺血；剂量；时间窗；H2O2；CAT；大鼠 　　[中图分类号] R338；R364 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）09-20-03 　　脑缺血损伤导致能量代谢障碍、线粒体功能异常、离子平衡失调、兴奋性氨基酸释放[1-2]，体内抗氧化防御系统受损，氧自由基产生和清除失衡，使机体处于氧化应激状态[3-4]。氧自由基攻击生物膜中的多聚不饱和脂肪酸引起脂质过氧化反应，诱发细胞凋亡[5-6]。自由基清除剂通过降低脑组织氧化应激水平，践行缺血损伤程度[7-8]。过氧化氢酶（CAT）可将H2O2分解为分子氧和水，清除体内的H2O2[9]。细胞培养研究证实，胡黄连苷Ⅱ可减轻H2O2诱导的PC12细胞损伤[10]，抑制细胞线粒体膜电位的降低[11]。动物实验表明，胡黄连苷Ⅱ可抑制大鼠脑缺血半影区神经细胞凋亡，减小脑梗死体积而达到神经保护作用[12]。作者前期研究发现，在 　　大鼠脑缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg剂量胡黄连苷Ⅱ可取得最佳疗效[13]。本实验试图定量检测血清和脑组织H2O2水平和CAT活性的变化，探讨胡黄连苷Ⅱ在脑缺血损伤中的抗氧化作用及最佳治疗剂量和时间窗。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物模型 　　成年健康雄性SPF级Wistar大鼠30只，体重230～250 g，青岛市药物检验所实验动物中心提供（SCX。动物置实验室适应环境1周，自由进食、饮水；室温（23±2）℃，自然光照。随机取5只为假手术组，其余动物分离并结扎双侧经总动脉建立前脑缺血模型[14]。术前动物禁食12 h，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/kg），仰卧固定、无菌操作，术后2 h仍未苏醒或死亡的4只动物动物剔除，将成功的21只模型再随机分为模型组5只和治疗组16只。假手术组不结扎颈总动脉，其余操作同实验组。 　　1.2 设计分组 　　1.3 干预措施 　　胡黄连苷Ⅱ（CAS No：39012-20-9，纯度98%）由天津奎青医药公司提供，应用生理盐水溶解稀释成1%溶液，按[L16（45）]正交表设计，在相应的缺血时间腹腔注射相应剂量胡黄连苷Ⅱ。假手术组和模型组术后2 h腹腔注射等量生理盐水。 　　1.4 标本采集 　　大鼠给药24 h后，以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉，开胸经心脏取血4 mL，4000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存。然后立即经心脏灌注生理盐水200 mL，快速开颅，完整取脑，切除嗅球和额叶前部脑组织，自视交叉向后切取缺血部位脑组织500 mg，置预冷研钵中研磨至粉末状后按1∶4比例加细胞裂解液（碧云天生物技术研究所），超声波匀浆，4℃冷冻离心机（Eppendorf 5801型，德国）12 000r/min离心10 min，去沉淀组织留上清液，BCA法测定蛋白浓度，-20℃保存。 　　1.5 检测指标 　　应用光化学方法分别测定血清或脑组织匀浆中过氧化氢（H2O2）水平和过氧化氢酶（CAT）活性。按试剂盒（南京建成生物公司）说明书操作，取血清或脑组织匀浆室温复溶，离心取上清100μL，以紫外分光光度计（Beckmann DU640，USA）在波长751 nm（H2O2）和405 nm（CAT）处测定吸光度值，计算H2O2（mmol/L）含量和CAT（U/mL）活性。 　　1.6 统计学处理 　　应用SPSS17.0软件进行数据统计。根据结果分析不同水平的缺血（给药）时间和剂量以及时间-剂量交互作用对检测指标是否有显著性影响，得出最佳剂量和时间窗。 　　2 结果 　　交互作用（C）均无显著性影响（P0.05）。应用最小显著差数法（LSD）对各组数据进行两两比较显示：血清H2O2含量