尿多酸肽作用于肺肿瘤小鼠的研究.docVIP

尿多酸肽作用于肺肿瘤小鼠的研究 　　摘要：目的 研究尿多酸肽（CDA-2）作用于转移性肺肿瘤小鼠的机制。方法 通过注射鼠Lewis 肺癌细胞到C57BL/6小鼠体内建立小鼠转移性肺癌模型。采用HE染色对小鼠肺部肿瘤数、肿瘤大小进行评价。利用Kaplan-Meier（K-M）生存率曲线分析小鼠生存情况。免疫组化方法检测小鼠肿瘤增殖抗原Ki-67的表达；TUNEL凋亡免疫组化染色观察肿瘤细胞的凋亡。结果 经CDA-2治疗后，小鼠的肺肿瘤数和最大肿瘤尺寸均显著低于PBS组肿瘤小鼠，并且CDA-2呈剂量依赖性抑制肿瘤的生长（均P0.05）。K-M结果显示，使用PBS组肿瘤小鼠的生存时间显著低于CDA-2治疗组，且随着CDA-2剂量增加肿瘤小鼠生存时间不断延长。免疫组化染色结果显示，肺肿瘤小鼠经CDA-2治疗后，Ki-67阳性肿瘤细胞数显著低于PBS治疗的肿瘤小鼠（P0.05）；而肿瘤凋亡细胞数却明显高于PBS组（P0.001）。结论 CDA-2可抑制小鼠肺癌的生长；延长肺癌小鼠的生存期；抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡。 　　关键词：尿多酸肽；肺癌；肿瘤生长；生存期；增殖；凋亡 　　根据2010年癌症统计数据显示，肺癌已成为全球死亡率最高的肿瘤[1]，其主要原因是患者在发现肺癌时多处于中晚期且现有的治疗方案，如手术、放疗和化疗等，均存在一定缺陷，不能起到有效的治疗作用。尿多酸肽（cell differentiation agent 2，CDA-2）作为我国研发的一种抗肿瘤新药，是从健康人尿中分离提取的含有天然活性成分的非细胞毒性药物，该药具有促进细胞分化及诱导细胞凋亡等功能[2]。前期临床研究显示，CDA-2对白血病和肝癌等多种实体和非实体肿瘤有较好疗效及防预[3，4]。本研究通过建立小鼠转移性肺癌模型，观察CDA-2对小鼠肺部肿瘤生长的影响、肿瘤小鼠生存时间的影响及肿瘤细胞增殖或凋亡的影响，来初步了解CDA-2在肺癌治疗中的作用。 　　1资料与方法 　　1.1实验动物 C57BL/6雌性小鼠购自国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心。 　　1.2主要试剂 胎牛血清购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基、青霉素、链霉素购自美国Hyclone Laboratories 公司；CDA-2由合肥永安制药有限公司惠赠；鼠抗Ki-67 购自英国Abcam公司；EnVision +System-HRP （AEC）试剂盒购自美国Dako公司；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒购自Promega公司。 　　1.3实验方法 　　1.3.1 细胞培养 鼠Lewis 肺癌 （Lewis lung carcinoma，LLC）细胞来源于美国菌种保藏中心，在DMEM完全培养液（添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素） 中常规培养。 　　1.3.2 动物模型的建立及CDA-2治疗方案 通过尾静脉注射法，将2×105个LLC肿瘤细胞注射到C57BL/6小鼠体内。14d后， PBS（对照组）及不同浓度CDA-2（500，1000，2000 mg/kg）分别通过腹腔注射入小鼠体内，1次/d连续10d。 　　1.3.3小鼠肺肿瘤评价方法 根据文献[5]对小鼠肺肿瘤的肿瘤数和最大肿瘤尺寸进行评价，具体方法：在第25d，PBS组和CDA-2组小鼠被处死，先用4%多聚甲醛经小鼠气管对肿瘤负荷的肺进行灌注，然后将整个肺取出，存放到4%多聚甲醛中固定。固定24h后，全肺被石蜡包埋。将肺肿瘤石蜡块切成连续的350 mm的切片，用HE染色后，对肺肿瘤进行计数和测量肿瘤的尺寸。 　　1.3.4免疫组化检测 肿瘤负荷肺组织用4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋、切片。切片经60℃孵育过夜后脱蜡，再将其放于0.01M柠檬酸缓冲液（pH6.0）中，微波炉100℃加热20min进行抗原修复。切片用3% H2O2抑制非特异性氧化酶后，在2% 封闭液中孵育60min，然后加Ki-67抗体4℃孵育过夜，根据EnVision +System-HRP （AEC）试剂盒说明书进行第二抗体的孵育和染色，复染使用苏木精。Ki-67阳性细胞统计方法：每张切片选择6个高倍视野，共观察1000个肿瘤细胞，计算平均阳性细胞比例，以百分率代表Ki-67阳性细胞比率。 　　1.3.5 TUNEL检测 蜡块按常规切片， TUNEL检测操作按Promega公司细胞凋亡原位检测试剂盒说明书规范进行。设阳性和阴性对照。TUNEL 染色阳性细胞棕黄色颗粒位于细胞核。每张切片选择6个高倍视野，共观察1000个肿瘤细胞，计算平均阳性细胞比例，以百分率代表肿瘤细胞凋亡率。 　　1.4统计学处理 实验数据以x±s表示。两组或多组间比较采用t检验和Kaplan-Meier生存分析。以P0