生防蜡样芽孢杆菌905转座子插入突变体库构建.pdfVIP

生防蜡样芽孢杆菌905转座子插入突变体库的构建 高坦坦，李燕，牛 彝，李丽华，王琦’ 中国农业大学植物病理学系．农业部植物病理学重点开放实验室，北京，100193 芽孢杆茵，温室和田阃应用结果显示。该细茵在小麦、水稻等很多作物上都表现出促生和防病效果， 能在小麦根际稳定定殖。本实验室前期研究发现B．cereus905的细胞破碎液中含有大量的SOD。当 soda MnSOD的编码基因 缺失突变后。且cereus905在小麦根围的定殖能力与野生型菌株相比 急剧下降。说明SOD与有益茵B．cereus905在小麦根围的定殖能力密切相关。在纳米二氧化钛 Ti02 光催化氧化胁迫下．sodA缺失突变体存活能力相对于野生型丑cereus905显著下降，功 能互补sodA后能突变株的存活能力恢复到野生型水平，深入研究发现B．cereus905sodA的表达水 平在Ti02光催化氧化胁迫下显著提高，表明MnSOD在置cereus905抵御纳米Ti02光催化氧化毒 性过程中起重要作用。目前对且cerel姻905定殖的分子机制还仅局限于对SOD的研究。其它方面 905 尚不清楚。转座子标签技术是研究功能基因的有效的工具之一，因此，本研究将构建且cereus 转座子随机插入突变体库。为深入研究且cereus905定殖的分子机制奠定基础。 pMarA转座质粒具有高效和稳定的优点，目前已经成功用于枯草芽孢杆茵，苏云金芽孢杆茵 插入突变体库的构建。pMarA是一个大小为8253bp的转座质粒。其上舍有转座子ThYLB．1和温 上跳跃到B．cereus 905基因组上；由于repGp复制子不能复制，在高温条件下。未发生转座的pMarA ErmR,KanR 将被消除；因此转座子成功插入到基因组上的菌株对卡邢霉素具有抗性，而对红霉 905接种至LB培养液中，37℃振荡 素敏感 Erms，KanR o本实验中，将带有pMarA的置cereus 培养12h，诱导TnYLB—l发生转座；取合适茵液稀释LB涂板 无抗性 。46℃高温培养8h，挑 培养过夜；挑取具有卡那霉素抗性而对红霉素敏感的单茵落至LB Kan，50¨虮nL 平板上保存 905中的转座效率为9．8×103， 备用，这些菌株即为插入突变子。实验结果显示，pMarA在且cereus 比报道的其在枯草芽孢杆茵中的转座效率高。随机挑取15个单茵落，提取基因组，用EcoRI酶切 12h，进行southernblot分析，结果显示80％的突变子是转座子单位点插入基因组中；从中挑取了 7个茵落。提取基因组，进行采用反向PCR及测序技术检测插入住点，测序结果显示插入住点的 序列均不同，表明TnYLB．1转座子的插入为随机插入。以上结果表明，利用37℃诱导转座，46℃ 消除质粒技术使转座子TnYLB．1转座子随机插入到且cereus905基因组上，成功构建了B．cerell$ 905的转座子插入突变体库。 量cereus 905突变体库的建立，不仅有助于揭示且cerel捃905定殖的分子机制．而且有助于探 索提高晟cereus905生防效果的途径。 关键词：生物防治；蜡样芽孢杆菌；pMarA；突变体库；转座子标签技术 中国农业大学基本科研业务专项资金项目。 作者简介：高坦坦 1988一 ．女，山东济宁人，博上，中田农业大学植物稿理学系，E-maih gaotantan0537@163．c蛐． ‘通讯作者：王琦，教授，主要从事植物病害生物防治与微生态方由i研究，F．,-imlilt wangqi@cau．exlu．cn． 85