四君子汤对脾虚大鼠空肠黏膜损伤修复作用与机制.pdfVIP

中国畜牧兽医学会中兽医学分会2011年学术年会论文集 四君子汤对脾虚大鼠空肠黏膜损伤的修复作用及机制 刘发强1，麻武仁1，昝军兰2，徐霄龙1，万长荣1，张挪威1，刘凤华2许剑琴2 1中国农业大学动物医学院中兽医实验室，北京，100193；2北京农学院动物科技系， 北京，102206 中 兽 医脾虚证多表现消化系统功能障碍，证见完谷不化，食后作泻，大便稀溏，消瘦等。近年 来研究表明，脾虚证患者和大鼠模型的胃肠道组织会出现病理变化，如胃黏膜变薄，小肠绒毛损伤、萎 缩，细胞器非正常变化等【l】。当肠黏膜损伤时，机体启动一系列反应保证黏膜结构的完整性，其中一个 重要的反应是肠组织再生，这是由肠干细胞参与的非常复杂的过程。细胞增殖标记物——增殖细胞核抗 Cell 原 Proliferating 殖状态的重要指标12J。肠道隐窝干细胞的分裂状态可以此作为评价指标。PCNA生长因子可以调节多种 细胞的增殖、移行和分化，在维持肠黏膜稳态及其结构完整性方面发挥着重要作用【3】。有研究表明，胰 岛素样生长因子．1 insulin-likefactor-1：IGF．1 可以加速肠黏膜损伤后的修复过程【4】。 growth 四君子汤由党参、白术、茯苓和甘草四味中药组成，是治疗脾虚证的经典方剂。目前已有研究表明， 四君子汤对大鼠和小鼠小肠免疫功能、胃肠运动等生理活动有重要调节作用【5’61，但在脾虚动物肠黏膜 损伤修复过程中作用研究甚少。空肠是食物消化、吸收的主要部位，为此，本试验检测空肠中PCNA和 IGF．1的表达，探讨经典方剂四君子汤对脾虚大鼠空肠修复过程的影响，为中兽医脾虚证之实质、四君 子汤的药理作用机制和临床应用提供理论基础。 l材料与方法 1．1药物及主要试剂、设备 成年SD雄性大鼠24只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。利血平注射液 1mg／m1 购自 广东邦民制药有限公司。四君子颗粒 党参、白术、茯苓和炙甘草 ，购自湖北武当生物制药有限公司。 PCNA多抗 北京博奥森生物技术有限公司，中国 ：兔抗大鼠IGF．1单抗 SantaCruz，美国 ；兔抗体 免疫组化试剂盒 南京凯基生物技术发展有限公司，中国 ；BH2型生物显微镜 Olympus，日本 。 1．2动物分组、处理和样本采集 试验大鼠24只适应性饲养3天后，随机分为对照组、脾虚组、四君子颗粒治疗组和治疗对照组，每 组6只。试验第1．7天，脾虚组、四君子颗粒治疗组和治疗对照组大鼠以0．5 ml／k9171剂量腹腔注射利血平， 对照组以相同剂量和方法注射生理盐水。试验第8天，处死脾虚组和对照组所有大鼠，每只大鼠取空肠 中段5cm，置于4％中性甲醛溶液固定，用于制作石蜡切片。四君子颗粒治疗组于试验第8天开始每天灌 na／kg／a 剂量根据人和大鼠体重换算，系数为0．018Is]；四君子颗粒 服浓度为0．59／rnL的四君子颗粒，8 用蒸馏水溶解 ，治疗对照组灌服相同剂量生理盐水，连续5天，于试验第13天处死两组大鼠，采样及样 本处理和保存方法同脾虚组。 1．3空肠组织HE染色 石蜡切片经二甲苯常规脱蜡，二甲苯：无水酒精 1：1 、无水酒精、95％一500,4下行梯度酒精中各5min， 迥讯作者：许剑琴，iianoinxucau@126．com；刘风华，．1iufenghual209@126．eom． 41 3 中国畜牧兽医学会中兽医学分会2011年学术年会论文集 苏木精染色约10min，蒸馏水冲洗、O．5％盐酸分色后，自来水冲洗蓝化30rnin，经蒸馏水冲洗、酒精脱 水上行至95％后，放入0．5％伊红酒精染液染色30s，再依次入95％酒精、无水酒精、二甲苯，最后用中 性树胶封片。 Plus 光镜下观察比较各组大鼠肠黏膜形态结构的变化，采用Image—Pro5．1图像分析系统，测量空 肠绒毛长度、隐窝深度，每个肠道组织切片选取5视野进行统计，取其平均值。 1．4 PCNA和IGF-1免疫组织化学法染色 常规方法制作石蜡切片，切片厚度4¨m。 min洗 1 常规脱蜡水合二甲苯5min洗2次，二甲苯：无水乙醇 1：1 5min洗1次，无水乙醇5 5 2次，95％、900／6、80％、70％、5004的乙醇各5min洗1次，ddH20min洗1次，PBS5min洗3次。 min3次 。 6．0 于微波炉中煮沸 高火5min，中低火3 2 抗原修复用柠檬酸钠缓冲液 pH 修复后，组织切片自然凉至室温。 3 封闭内源性过氧化物酶3％H202室温孵育20min。PBS中5min洗3次。 min。 4 1％山羊血清37℃封闭20 5 一抗孵育组织切片于200倍稀释的抗体溶液中4C孵育过夜。PBS中5min洗3次。 min。 6 在抗兔生物素化二抗中，37℃孵育30min。PB