探究细胞学免疫组化染色抗原修复合理选择.pdfVIP

201 1年全国病理技术新进展研讨会论文汇编 结论我们通过40例肌肉活检标本的诊断，探讨了肌肉活检技术方法的应用和改进，对 于各种染色方法在肌肉活检诊断中的应用价值有了新的认识。肌肉活检染色方法有多种，不 同方法各有用处，对诊断相应疾病有特异性价值，可根据疾病选择相应染色。 50．探究细胞学免疫组化染色抗原修复的合理选择 袁士成1，张望歆1，陈妹琼1·杜平I李庆勇2 9张秀圆3李为枨1 1．中人民解放军第305医院病理科，北京100017； 2．中国人民解放军第305医院中心实验室，北京100017； 3．北京市昌平区妇幼保健院，北京102206 随着免疫组织化学检测在病理诊断中的应用和发展，免疫组化染色已成为现代病理诊断 中不可缺少的检测技术，特别是在判断肿瘤组织来源、分类以及良恶性肿瘤的鉴别诊断等方 面起着重要的作用Ⅲ。对于活体组织免疫组化染色技术已经相当完善了，但是细胞免疫组 化技术还不是特别成熟。细胞免疫组化染色主要有遇到两个问题，一是如何充分的暴露抗原 决定簇，提高细胞膜的通透性，使抗体大分子物质易于进入细胞‘21，以便于抗体与抗原更 好的结合；二是恰当的固定，尽可能保持细胞的形态结构完整，防止细胞从玻片上脱落。因 此对于细胞免疫组化的抗原修复方法提出了更为苛刻的要求，我们针对现在比较常用的细胞 组织免疫组化修复方法并结合活体组织免疫组化的修复方法做了比较深入的染色实验与研 究，希望能找到做细胞免疫组化更为合理的实验方法和抗原修复方法。 l材料和方法 1．1细胞采用L．02正常人肝细胞株，购自中国医学科学院。细胞贴壁生长，生长培养基为 含有lO％胎牛血清的DMEM高糖液。 1．2主要试剂和仪器 2000系统液基薄层细胞检测仪 北 细胞保存液 北京英硕力新柏科技有限公司 ，Thinprep 柠檬酸盐抗原修复液 Manxin．Bio ，ElivisionTM Plus 单克隆抗体 Manxin．Bio ，TritonX．100 Manxin．Bio ，加强型DABKit Manxin．Bio ， 1．3细胞制备取培养的细胞，调整细胞浓度为l×106／ml。用无菌吸管吸取上面的细胞悬液 2000系统薄层细胞检 滴入盛有Thinprep细胞保存液的小瓶中，保存液中的细胞经Thinprep 测仪程序化处理，制成直径为2cm的薄层细胞涂片，95％酒精固定131。 1．4细胞免疫组化染色 1 实验分组与染色规则 分组 染色规则 实验组 透膜后高温高压修复 对照A组 透膜 对照B组 高温高压修复 对照C组 高温高压修复后透膜 2 实验组染色步骤 2000薄层细胞检测仪制成的玻片，用95％酒精固定15分钟后，在室温下 ①经Thinprep 94 2011年全国病理技术新进展研讨会论文汇编 再进行自然干燥10分钟。 ②用蒸馏水稍微水洗后，每张玻片上滴加1％TritonX．100试剂室温下孵育30分钟以增 加细胞膜的通透性，然后PBS磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次2分钟。 ③根据抗体要求，用高压锅对玻片上细胞中的抗原进行高温高压热修复，加热至沸腾， 喷气后开始计时2分钟，用冷水迅速冲至室温，取出玻片，用蒸馏水冲洗3次，每次1分钟。 ④除去玻片上残留的蒸馏水，加l滴或50ul的3％H202去离子水，室温下孵育5．10分 钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性，先用蒸馏水冲洗3次，每次1分钟，再用PBS磷酸 盐缓冲液冲洗3次，每次2分钟。 ⑤除去PBS磷酸盐缓冲液，每张玻片加1滴或50ul的一抗Bcl．2鼠单克隆抗体，室温 下孵育5．10分60钟 或是4。C冰箱过夜 ，用PBS磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次2分钟。 ⑥除去PBS磷酸盐缓冲液，每张玻片加l滴或50ul的聚合物增强剂 试剂A ，室温下 孵育10分钟，用PBS磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次2分钟。 ⑦除去PBS磷酸盐缓冲液，每张玻片加1滴或50ul的酶标抗鼠抗兔聚合物 试剂B ， 室温下孵育10分钟，用PBS磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次2分钟。 PlusKit ⑧除去PBS磷酸盐缓冲液，每张玻片加l滴或50ul的新鲜配制的加强型DAB 显色，显微镜下观察2．5分钟。 ⑨自来水冲洗，苏木素衬染，0．1％盐酸酒精分化，0．1％氨水返蓝，梯度酒精脱水，二 甲苯透明，中性树胶封固。 3 对照组染色步骤 ①A组只用l％TritonX．100透膜，且不经过高压高温热修复，其余步骤不变。 ②B组不经过1％TritonX．100透膜，只对玻片上的细胞进行高温高压热修复，其余步 骤不变。 ③C组先对玻片上的细胞进行高温高压热修复，用1％TritonX．100透膜，其余步骤不 变。 1．5结果观察与判定标准阳性信号均定位于细胞浆，阳性着色为胞浆内的棕色细小颗粒。 表达强度根据细