Claudin-1荧光真核表达载体构建及其在HepG2肝癌细胞中表达.pdfVIP

目 录 中文摘要…………………………………………………………………1 英文摘要…………………………………………………………………3 实验设计及流程…………………………………………………………5 前言………………………………………………………………………6 实验材料与方法…………………………………………………………10 实验结果…………………………………………………………………27 实验讨论…………………………………………………………………30 实验结论…………………………………………………………………32 参考文献…………………………………………………………………33 附录………………………………………………………………………36 致谢………………………………………………………………………37 综述………………………………………………………………………38 Claudin-1 荧光真核表达载体的构建及其 在 HepG2 肝癌细胞中的表达 中文摘要 目的 目前普遍认为细胞连接的破坏,与肿瘤细胞的浸润和转移与细胞间的黏附力 丧失相关[1] 。黏附连接和紧密连接两种连接方式是上皮细胞之间的黏附主要方式， 其中紧密连接位于细胞的侧面顶端, 维持细胞间离子及分子的选择性渗透。在紧密 连接处存在一个有 3 种已知的跨膜蛋白组成的整合体,包括闭锁蛋白、连接黏附分 子和 Claudin 蛋白。Claudin 蛋白是紧密连接的主要成分，并主要通过蛋白激酶途 径参与细胞与细胞之间的信号转导。近来有研究报道,Claudin 蛋白的异常表达与恶 性肿瘤的进展相关[2] 。Claudin-1 是一种紧密连接蛋白，属于 claudin 家族成员，在 [3] 肝脏中高度表达，其他上皮组织中也有表达 。近年来研究发现，claudin-1 的异常 表达与肿瘤的发生密切相关，成为肿瘤领域研究的热点[4] 。本实验构建了人 claudin-1 基因的真核表达载体，转染 HepG2 细胞，为研究 claudin-1 在肝癌增殖转 移过程中的作用提供了很好的研究对象。构建 pDsRED1-Claudin-1 重组质粒，并在 HepG2 肝癌细胞中进行表达。 方法 采用提取 HepG2 肝癌细胞总 RNA ，利用RT-PCR 技术合成 Claudin-1 基因， 使用 XhoI 和 BamHI 酶切消化 PCR 产物及 pDsRED1-N1 载体，回收目的片段及载 体，T4 连接酶 4 ℃连接过夜，转化到 DH5α感受态细菌，挑克隆，PCR 及酶切筛 选和鉴定重组质粒 pDsRED -Claudin-1，通过脂质体法转染HepG2 肝癌细胞后，进 1 行荧光检测和 Western blot 分析。 结果 成功构建真核表达质粒 pDsRED -Claudin-1，转染HepG2 细胞后,经荧光检测 1 和 Western blot 分析可见 Claudin-1 红色荧光融合蛋白正确表达