LPL基因变异筛查及小鼠ApoCⅡ克隆和表达.pdfVIP

天津医科夫学硕L论文 摘 要 脂蛋白脂肪酶(1ipoprotein lipase，LPL)是血浆腊蛋白代谢的关键酶，其 可将乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯水解为甘油和游离脂肪酸供组 织利用。载脂蛋白cII(ApolipoproteinCII，ApocII)作为脂蛋白脂肪酶的 必需激活因子，可激活LPL，在脂类代谢中发挥着重要作用。ApocII结构、 水平、功能异常和LPL基因变异会使脂蛋白脂肪酶(LPL)活性降低，导致 脂蛋白代谢紊乱，发生异常脂蛋白血症。异常脂蛋白血症是最常见的代谢性 疾病之一，也是动脉粥样硬化的重要危险因子。 本实验分为两部分，第一部分为探讨中国人群LPL基因常见突变的种类、 频率以及其可能产生的影响，我们利用聚合酶链反应．单链构象多态性 (PcR．SScP)分析技术对203例人群LPL基因转录起始位点上游140bp以 内的调节区和外显子4(包括内含子矽h显子交界区)进行了突变的筛查。在 203例样品中检出1例发生在外显子4扩增区域的可疑突变，通过PcR产物 直接测序，证实为内含子3受位剪接位点上游6bp的c—T转换突变杂合予， 未检出其他突变。目前该突变仅发现于臼本和中国，尚未读到其他国家的相 关报告。结合国内外相关文献和分子流行病学调查，以及关于突变基因结构 和作用机制的讨论，显示该突变可能是中国人高甘油三酯血症的遗传易患因 素之一。与以往国内外报道该突变仅见于高甘油三酯血症患者不同，本次在 一名衄脂正常人员检出LPL基因内含子3C—T突变，对探讨该突变的可能影 响具有一定的参考价值。 第二部分为小鼠载脂蛋白CII的克隆和表达。首先从小鼠肝组织提取总 因编码序列，将小鼠载脂蛋白cII编码基因片段重组入质粒pucl8，得到重 天津医科大学硕十论文 在此基础上，自pUCl8．r以pocII酶切ApoCII基因编码序列的DNA片段， 11 重组入融合表达载体pGEX一3X，得到pGEX，mouseApoC0GEX．mApocII) 重组表达载体，并进行序列测定。测序证实重组质粒puCl8巾认poCII及 肠杆菌DH5Ⅱ中，经lPTG诱导表达、亲和层析纯化后获得了融合蛋白 GsT-mApocII，sDs和westem B10劬19检测证明融合蛋白与我们所预 期的目的蛋白分子量接近，并且融合蛋白具有免疫原活性。该实验成功构建 了含编码小鼠Apoc II和原核表达载 II基因的重组克隆载体pucl8．mApoc 体pGEX—mApocII，并进行了诱导表达。选用pGEX．3x质粒作为表达载体 是因为其可诱导高效表达，所表达的融合蛋白既可减少宿主菌蛋白酶的水解 作用又纯化方便，并且通过表达出融合蛋白轻而易举的解决了ApoCll分子 II，开展 量小，抗原性弱的问题，为以后基因工程生产有生物活性的Apoc II治疗高甘油三酯血症的可能性奠 ApocⅡ的免疫学测定及进一步探讨Apoc 定了基础。 关键词：脂蛋白脂肪酶载脂蛋白cII聚合酶链反应～单链构象多态性逆转 录一聚合酶链式反应基因突变基因克隆基因表达 天津医科大学硕士论文 Abstract Lipoprotein a of Hpase(LPL)iskeyenzymelipidm心由olism，itsmajor ‰c廿onisthe core