蒙古绵羊Bcl-2基因5′端cDNA的克隆及序列分析.pdfVIP

2015年第2期 (总第 217 试验研究 试验研究 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 蒙古绵羊Bc1．2基因5~NcDNAflCJ克隆及序列分析 郭宏儒 (内蒙古民族大学动物科技学院 通辽 028043) 任秀珍 (内蒙古民族大学农学院) 曹贵方 (内蒙古农业大学动物胚胎与发育生物学研究室 内蒙古 呼和浩特) 摘要 为扩增蒙古绵羊bc1．2基因5，端，根据GenBaIlk上已公布的牛的序列，设计了2条引物。从蒙古绵羊脾中提取总 RNA，采用RT-PCR~-(术扩增 bc1．2~eDNA，并 ~FI~1]pBlueselectT载体 ，经限制性内切酶谱分析~6,DNA序列测定，测 出5RACE产物434个核苷酸序列，该序列包括c端144个氨基酸编码序列、翻译起始密码子ATlG。 关键词 绵羊 Bc1．2基因 克隆 5RACE cDNA 中图分类号：$826．8+2 文献标识码：A 文章编号：1007．1733(2015)02．0001．02 Bc1．2基因(即B细胞淋巴瘤 ／白血病．2基因)是一种原癌 Pliliil~-．5，一3GCGGAT0CACAGOCTACTGA1．GATCAG1[℃ GA11G 基因，近年的研究证明它具有抑制凋亡的作用 。1972年 - 3，P6：5．TTGATTTCTCCTGGC TGTCTC ·3。 Kerr[1首先提出了细胞凋亡的概念 。细胞凋亡 (apoptosis) 1．4 蒙古绵羊脾组织总RNA的提取 采用Promega公司的 与生物学和医学关系密切，是现代科研领域中重大课题 总RNA提取试剂盒，按其说明进行。最后用无RNA酶去 与研究热点之一。1980年Wyllie[2】发现核酸内切酶激活引 离子水溶解RNA沉淀，．70C保存备用。 起凋亡细胞DNA特异性梯形带(1adderpaaem)的形成，引 1．5 利用RT．PCR方法克隆Bc1．2的中间片断 (1) 起了发育生物学、细胞生物学、免疫学、神经生物学、 cDNA第一条连的合成：提取蒙古绵羊脾组织总RNA。反 分子生物学、肿瘤学等研究工作者的广泛兴趣，并重新 转录反应组分总体系为10p,h 总RNA4．5gl、10xRTbuffer 引起了世界范围内对细胞凋亡研究的热潮 3【】。 lgl、MgC12(25mM)2gl、 dNTP Mixture(10mM)1gl、 1 材料与方法 RNaseInhibiter(40U／g1)0．25gl、AMVReverseTranscriptase 1．1 试验对象及组织 蒙古绵羊取 自于内蒙古穆斯林屠 Xl(5U／~t1)0．5gl、OligdT(2．5~tmol／!)0．5gl、RNase Free 宰场。取新鲜脾脏液氮保存备用。 dH20 0．251xl。反应条件为：30℃10min、42℃30rain、 1．2 药品与试剂 琼脂糖、溴乙锭、总RNA提取试剂盒 95℃5min、5℃5min，将mRNA反转录成eDNA，用作 (Cat．NO．Z5110)购 自Promega公司。反转录RT-PCR试剂盒 PCR模版。(2)PCR反应：PCR反应组分总体系为50~1： (Cat．NO．DRR019A)、PCR产物纯化试剂盒、5 RACE试 RT溶液10gl、5xPCRBuffer10gl、TaKaRaExTaq(5U／~t1) 剂盒(Cat．NO．D315)、限制性内切酶HindIII和XbaI、T4 0．25l’、 PI(10pmoYa／1)la／l、 P2(10pmol／e1)11、 dH20 连接酶、TaKaRaExTaqD