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运用代谢组学技术研究发现炮制引起大黄多成分变化 　　[摘要]利用代谢组学技术，对大黄全成分进行对比分析，研究生熟大黄各类化学成分的变化。应用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF）联用技术，获取大黄生品和熟品的色谱和质谱信息，采用多元统计分析技术对提取的324个特征峰进行比较分析。炮制大黄非靶向代谢组学研究中，发现大黄生品和熟品化学成分明显不同，与生大黄相比，炮制后有127个成分发生显著变化，其中125个成分含量降低，2个成分升高。该研究鉴定了其中的10个化合物，另外推测了其他23个成分的结构类型，其中15个为鞣质类，8个为蒽醌类，炮制均使它们含量降低。炮制大黄靶向代谢组学研究发现炮制使芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚含量降低。炮制显著影响大黄中多种成分的含量，代谢组学研究能够比较全面地揭示这种变化。 　　[关键词]超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱；大黄；代谢组学；炮制 　　中药大黄是最常用药材之一，中医临床常用炮制品入药，以熟大黄居多。熟大黄为大黄的干燥根及根茎以酒蒸或酒炖法炮制而成，其泻下力缓，泻火解毒[1]。熟大黄炮制过程本质上为加热过程，炮制后化学成分可能会发生部分成分的热降解或其他变化，从而导致药性药效的变化。因此，生、熟大黄化学成分的变化与功用的相关性研究具有重要的科学意义。目前报道[2-7]均未有从整体角度出发对大黄炮制前后化学成分进行整体研究。本文运用以生、熟大黄样本整体为分析目标的代谢组学方法，不局限于研究常见的几种化合物的变化，因为它们未必是大黄生熟异用的物质基础，而是对炮制前后大黄进行全谱数据分析，从大黄化学成分中找寻受炮制影响显著的化学成分。 　　1材料 　　Agilent 1290 Infinity-6520 Q-TOF LC-MS System。色谱纯甲醇为天津市科密欧化学试剂有限公司产品，色谱纯乙腈为Spectrum Chemical Mfg.Corp.产品，色谱纯醋酸为天津市科密欧化学试剂有限公司产品，水为Milli-Q超纯水。 　　生、熟大黄均由成都中医药大学提供，经成都中医药大学胡昌江教授鉴定为药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根茎，生大黄产地为四川，熟大黄120 ℃高压蒸制3 h，每100 g大黄加30 mL黄酒。 　　2方法 　　2.1样品溶液的制备 　　本实验以同一产地不同批次大黄生品和熟品为研究对象（7个批次），精密称取各个批次生大黄和熟大黄干燥粉末各1.00 g，每份药材粉末加入50%甲醇10 mL，浸泡16 h后样品超声提取30 min，3 000 r?min-1离心5 min，上清液过0.22 μm滤膜，待UHPLC-Q-TOF分析。 　　2.2超高效液相色谱-质谱联用分析条件 　　生、熟大黄全谱分析采用Agilent 1290超高效液相色谱系统串联6520 Q-TOF-MS。实验采用Agilent 公司ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（3.0 mm×150 mm， 1.8 μm），流动相0.1% 醋酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～15 min，5%～100% B，流速0.4 mL?min-1，柱温40 ℃，进样量1 μL，检测波长280 nm。质谱采用ESI离子源，负离子模式下采集数据，数据采集范围m/z 100～1 500，温度350 ℃，干燥器流速8 L?min-1，雾化气压力 275.86 kPa，毛细管电压3 500 V，Fragmentor电压200 V，skimmer电压 65 V。 　　2.3数据处理 　　获取UHPLC-MS指纹图谱后，采用软件XCMS进行特征峰提取，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的三维数据矩阵。把数据矩阵导入软件MetaboAnalyst2.0（http：// www. metaboanalyst. ca/MetaboAnalyst/faces/Home. jsp）中，采用主成分分析（PCA）得分图直观的表示炮制前后组间差异；通过偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）的VIP值筛选炮制前后变化显著的化学标志物；找到的化学标志物通过Metlin代谢组学数据库（http：///index.php）鉴定。 　　2.4化合物的鉴定 　　本实验通过一级质谱确定精确相对分子质量，二级质谱获得断裂信息，结合Metlin搜索及已报道文献来推测化合物。 　　3结果与讨论 　　3.1数据的获取与处理 　　代谢组学通过比较对照组和实验组的代谢组（metabolomes，某一生物的所有代谢物组分）以寻找代谢谱的差异。代谢组学得到的是大量、多维的信息，为确保质谱信息的质量，本研究进行了样品提取和质谱分析的优化，获得了高重复性的数据。为降低系统引起