疫霉激发子的分离纯化和激发素基因的克隆与表达.pdf

致 谢 本论文是在浙江大学生物技术研究所梁五生副教授的悉心指导下完成的。导师治学 严谨，学识渊博，品德高尚，平易近人，为人豁达，在我学习期间不仅传授给我了做学 问的秘诀，还言传身教了许多做人的道理，这些都将使我终生受益。本论文从选题、实 验设计和论文的写作等每一个环节都凝聚着导师无数的心血，值此论文完成之际，谨向 我的导师梁五生副教授表示诚挚的感谢，感谢他对我的悉心指导、严格要求、热忱鼓励 和亲切关怀! 三年的研究生学习期间，有幸得到陈卫良老师的关怀，无论是实验上、文章修改还 是学习生活上，在此对陈卫良老师表示深深的感谢! 感谢臧荣春老师、周雪平老师、吴建祥老师、王政逸老师、王洪凯老师、胡东维老 师、林福呈老师、娄沂春老师、史文琴老师等在实验方面的指导和帮助! 感谢高其康老师、陈正贤老师在蛋白冻干浓缩方面给予指导和提供便利! 感谢张敬泽老师提供了疫霉真菌材料和实验指导! 感谢潘娟师姐、刘同宝师兄、姜玉新师兄、董波师兄、梁慎师兄、贡中军师兄、郭 小勤师姐、何秀霞师姐、刘小红师姐等在试验和生活上大力支持和帮助! 衷心地感谢我的好朋友胡琼三年来在学习生活中关心、照顾和无尽帮助!感谢胡金 强、曾志林、刘树蓬、张洪志等多位同学的支持和帮助! 感谢鲁玉杰师姐、杜梦芳师姐、安士恒师兄和杨波师兄等在生活上的关怀和帮助! 感谢一起学习生活的室友吴叶飞、周鑫、高柳燕，是她们的手足之情让远离家乡的我体 会到家庭般的温暖! 感谢在本实验室一起求学和工作过的陈吴健、刘逊亮、薛惠明、王栋梁师弟的帮助! 特别感谢我的家人，我的每一步成长都凝聚着他们的心血和汗水，他们是我学习和 生活的坚强后盾和精神支柱，在此，谨以此文表达我对他们最衷心的感谢和祝福! 最后，还向其他给予我关爱和帮助的，在此无法一～列出的各位老师、亲人、朋友 献上我最真挚的谢意! 詹海燕 2006年5月 摘 要 能与植物原生质膜上高度特异的蛋白受体结合从而诱导植物产生防卫反应的分子统称激发子， 其中从一些真菌菌丝细胞壁或培养滤液中提取的激发子尤其受关注。真菌激发子可被用于研究植物 过敏反应的机理，其编码基因有可能被用于转基因操作从而获得具有抗病性能的植物材料。本论文 以一分离自长春花叶片的疫霉为材料，开展了激发子的蛋白纯化，基因分离和原核表达等研究，主 要研究结果如下： 1．从疫霉培养液中通过沸水浴、硫酸铵沉淀、非变性电泳、割胶电洗脱等纯化步骤，分离得到 一种分子量约为31kD的耐高温的胞外分泌型蛋白。此蛋白在低浓度下能引起烟草叶片发生过敏反 有激发子活性。此蛋白的N一端氨基酸序列与一些已报道的疫霉激发子高度同源，但其分子量与己报 道的疫霉激发子有明显差异，有可能是一种新的疫霉激发子。 transcribed 2．真菌核糖体RNA编码基因的ITS(internal spacer)序列在种内保守性强，但在种 间变异丰富，被广泛用于亲缘关系较近的分类群的系统发育研究。本实验利用rDNA．ITS序列对所 用疫霉进行分子鉴定，序列同源性比对结果显示其rDNA．ITS序列与烟草疫霉的同源性高达99％以 上，据此推测所用疫霉可能属于烟草疫霉。 nicotiana激发素编码基因序列设计引物，以本文所用疫霉的RNA 3．以已知的Phytophthora 为模板，通过RT-PCR获得了激发索编码基因，同时获得了一个第63和223碱基发生了突变的序列， 此突变体的第63碱基G突变为A，但编码的第2l位氨基酸未变，仍是丝氨酸；然而第223碱基由A 突变成G则导致第75位氨基酸由苏氨酸变成了丙氨酸。第75位氨基酸在激发素诱导烟草过敏反应 中的作用还未见报道。将此激发素基因及其突变体分别转入pGEX-4T-1原核表达载体，转化大肠杆 菌，经IPTG诱导都能产生特异产物，表达产物的分子量均为36kD，恰好是激发素与GST分子量之和， 表明两种表达产物是融合蛋白。这两种融合蛋白在低浓度下接种烟草叶片和处理烟草悬浮细胞，均 能诱导烟草细胞死亡，处理悬浮细胞12hr后细