人脐血干细胞移植建立人小鼠嵌合肝动物模型的实验的研究.pdfVIP

第十次全国感染病学术会议暨第二届全国感染科医师大会 A20、人脐血干细胞移植建立人小鼠嵌合肝 动物模型的实验研究 四川大学华西医院感染病中心(610041) 王辉赵连三周陶友何芳 材料与方法 1 实验材料 1．1标本来源 人脐血标本由四川省妇幼保健院或锦江区妇幼保健院提供(均系采自健康男性新生儿断脐后胎 盘端的脐血，其孕母排除病毒性肝炎、艾滋病、梅毒等感染)，于采集后12h内，按照本实验室建 立的方法，进行单个核细胞分离。 1．2实验动物 阴性对照1只，余分为三组，移植组16只，肝切除对照组16只，空白对照组16只。 2．2动物分组、手术和脐血单个核细胞移植 2．2．1实验动物分组： 实验用雌性BALB／c小鼠共49只，除人Y染色体阴性对照1只外，余分为三组：细胞移植组、 肝切除对照组和空白对照组，每组各16只。 1．移植组：先行肝左外侧叶切除术，随即将PBS稀释的人脐血单个核细胞悬液0．1ml缓慢注射 入肝左内侧叶： 2．肝切除对照组：同上做肝左外侧叶切除术，随即将0．1mlPBS缓慢注射到肝左内侧叶； 3．空白对照组：仅切开腹腔，然后缝合，不做其他处理。 2．2．2肝部分切除术及细胞移植： 1．将麻醉后的小鼠仰卧位固定。 2．逐层打开腹腔，可见小鼠肝脏分为肝左内侧叶、肝左外侧叶、肝右内侧叶、肝右外侧叶、尾状 叶；自肝蒂处结扎并切除肝左外侧叶，10％中性甲醛固定备用； X 3．移植组小鼠肝左内侧叶注射PBS稀释的0．1ml源自男婴脐血的单个核细胞悬液I107织，肝 切除对照组小鼠肝左内侧叶注射0．1ml的PBS后缝合腹腔及腹壁皮肤。 2．3小鼠血标本和肝组织标本采集 2．3．1小鼠血标本采集： 按照表1中的时间点和安排，即术前、术后3d、术后7d和14d，对各组的相应小鼠均自眶底 静脉丛采集小鼠血标本。待本研究所有血清标本收集完毕后，检测ALT和ALB。 小鼠肝脏标本采集： 按照时间点和安排，即术后7d，14d，分别自上述三组随机选取的小鼠各8只放血处死，取移 植组和肝切除对照组小鼠的注射肝叶和非注射肝叶，空白组小鼠取全部肝脏。以10％中性甲醛固定 12—18h后，移入95％Z．醇室温保存。待本研究所有肝组织标本收集完毕后，石蜡包埋备用。 2．4组织芯片制备 按本实验室建立的方法，将移植组和肝切除对照组注射肝叶及非注射肝叶的标本制备组织芯片。 其中设置人Y染色体阳性标本对照(男性肝癌病人组织)、人Y染色体阴性标本对照(雌性小鼠肝 ．．233． 第十次全国感染病学术会议暨第二届全国感染科医师大会 组织)。 2．5移植组和肝切除对照组HE染色 FISH检测Y染色体(本实验均需避光条件下完成) ‘ 3．统计方法 计量资料(肝功能指标√岍、ALB)以均数-4-标准差表示，采用方差分析。检验水准o．0．05。 13．0。 统计软件用SPSS 结果 ． 3．1 人脐血干细胞的形态观察 每份脐带血约47～87mL(不含抗凝剂)，于脐血采集后12h内，通过密度梯度离心法，进行单 个核细胞分离。每份脐血可获得约5x107～lxl08个细胞。镜下观察：细胞大小不一；细胞形态各样， 可见圆形、多角形和梭形等。 3．2肝部分切除小鼠的一般情况观察 至观察时间点结束(14d)，所有实验动物均存活。移植组和肝切除对照组动物均于术后O．5．2 小时内苏醒；小鼠活动明显减少，不能自由饮水、进食；对外界光刺激不敏感。所有动物均于术后 6小时内开始活动、进食及饮水。术后1d观察，所用实验动物恢复自由活动，但头颈部毛发打绺， 无