西农萨能羊脂肪酸合酶基因启动子的鉴定和初步分析.pdfVIP

西农萨能羊脂肪酸合酶基因启动子的鉴定与初步分析 李君罗军’赵旺生朱江石恒波 (西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌712100) 引言 脂肪酸合酶是哺乳动物脂肪酸合成过程中的关键酶，它与能量贮存、生物膜的结构、信 号转导和蛋白质的乙酰化密切相关。脂肪酸合酶又是胞液中脂蛋白的主要成分，且与乳脂的 分泌途径紧密相关，它利用乙酰．CoA、丙二酸单酰．CoA和还原型辅酶II(NADPH)催化 饱和脂肪酸的合成。FASN在提高乳类的风味和品质方面具有重要作用，乳中的脂肪酸组成 是影响乳品风味和品质的重要因素之一，因此对脂肪酸合酶基因进行调控，达到生产出高品 质乳品的目标具有重要意义。山羊、牛以及一些非反刍动物在脂肪酸代谢，尤其是FASN调 控乳中脂肪酸碳链延伸过程中存在明显的差异。本研究旨在通过克隆FASN启动子、构建启 动子缺失片段的荧光素酶报告基因载体，确定FASN启动子核心区域，并对其功能进行初步 分析，为进一步研究山羊乳中脂肪酸合成代谢机理奠定基础。 材料与方法 采集西北农林科技大学萨能羊原种场健康的纯种萨能奶山羊血样8mL，苯酚．氯仿法提 取基因组DNA。通过Genbank中已收录的人、牛和小鼠等物种的FASN基因启动子同源性 设计引物，包括：FASN基因启动子克隆引物FS与FA；启动子缺失片段引物FSl、FS2、 I。以DNA为模板PCR FS3、FS4、FS5、FS6、FS7和FAl，并引入酶切位点BglII和Mlu 扩增FASN启动子序列和启动子缺失片段序列，连接荧光素酶报告基因载体pGL3一basic，与 PRL．TK内参质粒瞬时转染人乳腺癌细胞系MCF．7，48小时后按照双荧光素酶报告基因检 测系统检测荧光素酶报告基因活性。以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性比值作为 FASN启动子的相对荧光活性，进行数据分析。 结果 外显子，第一内含子以及第二外显子的部分序列，翻译起始位点ATG位于第--#b显子内， 第一外显子为非编码翻译区。重组报告基因载体经酶切鉴定重组成功，测序结果表明扩增的 FASN启动子各片段序列正确。荧光素酶活性分析结果表明，FASN启动子核心区位于转录 起始位点上游…29379区域。转录因子结合位点分析表明，FASN启动子含有典型的TATA 框，CAAT框和GC框，且含有潜在的E．box，SREBP—lc，SPl等结合位点。 讨论 启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，深入了解启动子的功能活性对于研究 基因并进一步调控其表达十分重要。荧光素酶活性分析表明，随着启动子片段的删减，启动 子活性逐渐降低。当从．293删减至．79时，启动子活性有很大的降低，而．79—．14仅有微弱 的启动活性，．14位点下游的片段几乎丧失启动活性，说明启动子的核心区域位于一293—．79 区域，这个区域可能含有激活启动子的关键顺式作用元件。然而从一79一．14区域还有微弱的 启动活性，在这个区域含有E．box，TATA框，这些是启动子的典型的结构特征。 转录因子结合位点分析发现，在一390处有雌激素受体的结合位点，．250，．150和一71位 点处有SREBP．1c的结合位点，以及胰岛素应答元件，NF．Y和Spl的结合位点。随着启动 子片段的删减，启动子活性呈现不同程度的降低，这种结果与删减掉不同的转录因子结合位 点有关。各转录因子对FASN的转录调控有待进一步研究。 致谢 本研究受转基因生物新品种培育科技重大专项(2009zx08009．162B)资助完成。