清热复方对高温刺激后大鼠空肠Hsp70的影响.pdfVIP

292 动物医学 京维通利华试验动物技术有限公司。随机分为对 1．3．2 Hsp70在空肠组织中的蛋白表达 照组、热应激组和中药组，每组各10只。对照组和 根据凯基全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物) 热应激组大鼠按3．0mL／只灌服灭菌生理盐水，中 从100mg空肠组织中提取总蛋白，样品书0℃保存 药组按3．0mL／只【6．25(g及g·bw)】灌服给药，连续备用；按照Hsp70检测试剂盒(美国RB)说明，采 5天，第5天，热应激组和中药组大鼠放于人工气 用双抗夹心ELISA法，利用核酸检测蛋白仪(美国 候仓中进行热应激处理，热应激条件为4l℃，60％ 湿度，2h后大鼠脱颈椎处死，分离空肠组织，用预 白的表达。用Hsp70蛋白表达和总蛋白的比值代 冷的生理盐水冲洗干净后，液氮速冻，一80℃保存 表Hsp70在空肠组织中的表达。 备用。 1．4数据统计 1．3方法 ANOVA分析。 SPSSl0．0统计软件one—way 1．3．1 Real—time PCR检测Hsp70的表达 2结果 (1)总RNA提取及RT—PCR。按照TRIZOL 总RNA提取试剂盒说明书提取空肠组织中的2．1大鼠临床症状及体温变化 RNA，提取完成后，用紫外分光光度计检测RNA的 对照组大鼠在整个热应激试验期间，精神状 纯度，1．2％甲醛变性胶电泳检测其完整性。RNA态良好，食欲正常，活动正常；热应激组大鼠在热 应激过程中表现精神烦躁不安，大量出汗以至浑 检测合格后用M—MLV反转录酶合成cDNA：取 2．0 dNTPs mmol／L)与2．0 身湿透，且张口呼吸，饮水增加，食欲减少；中药组 pLoligo—dTl8(10 pL mmol／L)加入到有2．0RNA(1 大鼠在热应激过程中也表现出烦躁不安，饮水增 (10 ftL p∥pL)的 0．2mL min，立即置冰 加，头及全身出汗。应激后立即测大鼠肛温，体温 Eppendof管中，75℃变性5 均升高，超过了40℃，和对照组比较差异均极显著， 上冷却。然后每管中加入2．O此M—MLV反转录 酶(200 说明均达到了高温刺激的效果。结果见表2。 U／gL)，8．0此5×反转录酶反应缓冲液(10 mmol／L)，O．8此RNA酶抑制剂(50U／此)，用灭菌 表2大鼠热应激后肛温变化 的0．I％DEPC处理水补足总体积至40此37℃反 肛温(℃) 应激前 应激后 应2h，95℃灭活反转录酶5min，立即使用或一20 ℃保存。 (2)荧光定量PCR。根据Genbank提供的序列， 引物使用Primer 5．0设计，由上海生物工程 注：与对照组相比，·户．O．05。·‘P．o．Ol premier 公司合成，引物参数见表l。应用Stratagene公司 mRNA的表达变化 2．2空肠组织Hsp70 的荧光定量PCR试剂，反应体系如下：cDNA：1．0 SYBRGreen master ¨L，弓J物1．O肛L，Briliant QPCR 熔解曲线峰值在86℃，两个曲线的熔解温度均 Mix10此，补水